Zellzyklus

Naturstoffwechsel (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Aminosäurehomöostase ist für viele zelluläre Prozesse von entscheidender Bedeutung. Es ist allgemein bekannt, dass Aminosäuren mithilfe von pH-Gradienten unterteilt werden, die zwischen Organellen und dem Zytoplasma erzeugt werden. Die Dynamik dieser Aufteilung wurde jedoch nicht untersucht. Hier entwickeln wir einen hochempfindlichen pH-Reporter und stellen fest, dass das Hauptspeicherkompartiment für Aminosäuren in Saccharomyces cerevisiae, die Lysosomen-ähnliche Vakuole, vor der Zellteilung alkalisiert und bei der Zellteilung wieder ansäuert. Die vakuoläre pH-Dynamik erfordert die Aufnahme extrazellulärer Aminosäuren und die Aktivität von TORC1, der v-ATPase und den Kreislauf des vakuolären spezifischen Lipids Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphat, das durch die Cyclin-abhängige Kinase Pho85 (CDK5 bei Säugetieren) reguliert wird. . Die vakuoläre pH-Regulierung ermöglicht die Sequestrierung und Mobilisierung von Aminosäuren aus der Organelle, was für die Funktion der Mitochondrien, die Ribosomenhomöostase und die Kontrolle der Zellgröße wichtig ist. Insgesamt stellen unsere Daten ein neues Paradigma für die Verwendung der dynamischen pH-abhängigen Aminosäurekompartimentierung während des Zellwachstums/der Zellteilung dar.

Die lysosomenähnliche Vakuole der Hefe ist das wichtigste Abbauorganell und ein Speicherort für Metaboliten, Aminosäuren und Ionen, die für die zelluläre Fitness in Zeiten von Nährstoffüberschuss und -knappheit unerlässlich sind1. Der makromolekulare Abbau und die Speicherung von Metaboliten im Lysosom/in der Vakuole erfordern die Aufrechterhaltung eines sauren Lumens im Verhältnis zum Zytosol, was größtenteils durch die hochkonservierte, ATP-abhängige, protonenpumpende Vakuolen-ATPase (v-ATPase)1 erreicht wird. Durch die Regulierung der v-ATPase-Aktivität wird die Vakuole funktionalisiert, um proliferative Entscheidungen für die Zelle zu treffen. Durch eine wechselseitige Beziehung mit dem Hauptwachstumsregulator TORC1 integriert die Vakuole verschiedene Stoffwechselsignale wie den glykolytischen Fluss und die Stickstoffverfügbarkeit, um anabole oder katabole Zellwege in Gang zu setzen2. Somit sind die Regulierung der v-ATPase, der vakuoläre pH-Wert und die TORC1-Signalisierung funktionell miteinander verknüpft, um verschiedene Aspekte des Zellstoffwechsels auszulesen und Entscheidungen über Wachstum/Nichtwachstum zu treffen.

Eine wichtige Funktion der Vakuole bei der Regulierung zellulärer Proliferationsentscheidungen beruht auf ihrer Fähigkeit, Aminosäuren zu speichern. Bemerkenswert ist, dass der Grad der vakuolären Aminosäurekompartimentierung sehr spezifisch für bestimmte Aminosäureklassen ist. In Hefe werden etwa 90 % der intrazellulären basischen Aminosäuren und 10 % der sauren Aminosäuren in der Vakuole gespeichert, während alle anderen Aminosäureklassen nur mäßig angereichert sind3.

Die funktionelle Bedeutung der diskreten Aminosäurekompartimentierung während des Zellwachstums unter nährstoffreichen Bedingungen ist nicht genau verstanden; Kürzlich wurde jedoch eine Konsequenz einer fehlregulierten Kompartimentierung gezeigt. Wenn Hefezellen altern, steigt der vakuoläre pH-Wert und der zytoplasmatische Cysteinspiegel, was sich auf die Mitochondrienfunktion auswirkt, indem es die Biogenese von Eisen-Schwefel-Clustern und die Fähigkeit der Organelle, kritische Aktivitäten auszuführen, verändert4,5. Diese Einsicht in die Bedeutung der vakuolären pH-abhängigen Kompartimentierung von Cystein für die Mitochondrienfunktion unterstreicht die Interkonnektivität der organellen Homöostase während des Alterns, wirft jedoch die Frage auf, ob die Kompartimentierung verschiedener Klassen von Aminosäuren in jungen, exponentiell wachsenden Zellen eine Rolle spielt.

Während viele Details zur Regulierung des vakuolären Säuregehalts und der Metabolitenspeicherung unter Bedingungen von Zellstress wie Hunger, osmotischem Schock oder Alterung entdeckt wurden, wurde die Dynamik der vakuolären pH-Homöostase unter konstanten Wachstumsbedingungen aufgrund des Mangels an molekularen Werkzeugen nicht erforscht . Insbesondere war es nicht möglich, die vakuoläre pH-Dynamik in einzelnen Hefezellen über lange Zeiträume mit hoher zeitlicher Auflösung und Empfindlichkeit zu beobachten.

Hier untersuchten wir die Zusammenhänge zwischen der vakuolären pH-Regulierung, der zellulären Aminosäurehomöostase und dem Zellzyklus in Hefe. Wir haben einen neuen Fluoreszenzreporter entwickelt, der für den niedrigeren pH-Wert des Vakuolenlumens optimiert ist, und ihn verwendet, um eine bisher unbeachtete zellzyklusbedingte Regulierung des Vakuolen-pH-Werts in Zellen zu entdecken, die in Gegenwart bestimmter Aminosäuren wachsen. Wir haben mehrere hochkonservierte molekulare Wege identifiziert, die diese Dynamik regulieren, und liefern Beweise für den Kreislauf des vakuolären Lipids Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphat (PtdIns(3,5)P2), das bekanntermaßen wichtig für die Koordination der Aktivität von TORC1 und der v- ATPase. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese pH-Änderungen die Ansammlung und Freisetzung von Aminosäuren in der Vakuole steuern. Die Blockierung der dynamischen vakuolären pH-Alkalisierung unter nährstoffreichen Bedingungen führt zu einer Hochregulierung der zytoplasmatischen Arginin-Biosynthesegene und einer gleichzeitigen Herunterregulierung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungs- und Ribosomengene. Phänotypisch führen diese zu einer gestörten Koordination der Größe, in der Tochterzellen produziert werden, und der Zeit, die sie in G1 verbringen, bevor sie eine neue Runde der DNA-Synthese beginnen.

Diese Daten liefern Belege für eine bisher unerwartete zellzyklusbedingte homöostatische Kontrolle der zytoplasmatischen Aminosäurespiegel und stellen ein neues Modell für die Regulierung des vakuolären pH-Werts und der Aminosäurekompartimentierung während des Zellwachstums dar.

Der Mangel an robusten Werkzeugen zur Überwachung von pH-Änderungen in sauren Organellen veranlasste uns, einen neuen Reporter zu entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir das pH-empfindliche fluoreszierende Protein, superekliptisches pHluorin (SEP)6, mutiert und seinen Fluoreszenz-pKa verschoben, um empfindlicher auf Veränderungen in sauren Umgebungen zu reagieren. Wir führten die Mutationen A227D/D147S aufgrund ihrer Auswirkung auf die pH-Abhängigkeit der fluoreszierenden Domäne von ArcLight7 ein und nannten das resultierende Fluorophor v-SEP (Abb. 1a). Um einen ratiometrischen vakuolär lokalisierten Reporter zu erstellen, wurde v-SEP mit dem pH-unempfindlichen roten Fluorophor mCherry fusioniert und mithilfe der ersten 50 Aminosäuren der vakuolären Hydrolase Carboxypeptidase Y (CPY) in das Lumen der Vakuole geleitet (Abb. 1b). .

a: Änderung der Fluoreszenzintensität von SEP (blaue Quadrate) und v-SEP (rote Quadrate) aus Zellen, die in situ mit Digitonin permeabilisiert und Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert ausgesetzt wurden. Die Fluoreszenz wurde mit einem Spektrophotometer gemessen. Der erwartete vakuoläre pH-Bereich ist in Magenta eingerahmt. b, Ein Schema des ratiometrischen pH-empfindlichen Reporters, bestehend aus dem säureempfindlichen v-SEP-Fluorophor und dem säureunempfindlichen mCherry-Fluorophor, der durch die N-terminale Fusion der ersten 50 Aminosäuren von Carboxypeptidase Y (CPY-Leader) auf die Vakuole gerichtet ist. Die mikroskopische Aufnahme zeigt beide Fluorophore in der Vakuole einer einzelnen Zelle. c, Zeitreihendaten zeigen das Verhältnis der vakuolären v-SEP-Intensität zur mCherry-Intensität über die Zeit für zwei repräsentative Zellen, die in Medium mit Glucose und Aminosäuren (SDC) gezüchtet und alle 2 Minuten für 1.000 Minuten in Mikrofluidikkammern (CellASIC) abgebildet wurden. Gestrichelte Linien zeigen den Zeitpunkt des Knospenaufgangs an. d, Die 1.417 ratiometrischen Einzelzellfluoreszenzspuren von v-SEP/mCherry in Zellen, die in speziell angefertigten Mikrofluidikgeräten in Gegenwart von SDC gezüchtet wurden. Die Fluoreszenzdaten werden auf den ersten Peak der vakuolären pH-Alkalisierung ausgerichtet. e, Einzelbilder von Zeitrafferdaten zeigen Hellfeld und das ratiometrische Signal des vakuolär akkumulierten BCECF. Absolute pH-Werte werden aus in situ erstellten Standardkurven berechnet. Ein roter Pfeil markiert den Höhepunkt eines vakuolären Alkalisierungsereignisses und die Änderung des Brechungsindex im Hellfeldfeld. f, Absolute pH-Änderungen, berechnet aus der ratiometrischen BCECF-Bildgebung, aufgezeichnet über die Zeit für zwei repräsentative Zellen. g, Spitzen-pH-Wert und minimaler pH-Wert, beobachtet über 129 Zellzyklusereignisse von 27 verschiedenen Zellen. Durchschnittswerte werden durch horizontale rote Balken angezeigt. h, Der Unterschied zwischen Spitzen- und Minimal-pH-Werten innerhalb von 129 diskreten Zellzyklusereignissen von 27 Zellen. Der Durchschnittswert wird durch einen horizontalen roten Balken angezeigt. i, Ein schematisches Modell zeigt vakuoläre pH-Änderungen, während Wildtyp-Zellen (WT) den Zellzyklus durchlaufen. In Zellen ohne Knospen (links) ist der pH-Wert der Vakuolen saurer, und wenn die Zellen wachsen (rechts), wird die Organelle weniger sauer.

Quelldaten

Wir verwendeten Mikrofluidikgeräte, um vollständig prototrophe Zellen zu immobilisieren und v-SEP und mCherry alle 2 Minuten für 1.000 Minuten (ungefähr zehn Zellteilungen) während des Wachstums in einer konstanten, definierten extrazellulären Umgebung (Wachstumsmedium mit essentiellen Nährstoffen, Aminosäuren und Glukose (SDC)) abzubilden )).

Unsere Analyse ergab einen bemerkenswerten dynamischen Aspekt der vakuolären pH-Regulierung. Wir beobachteten regelmäßige Zunahmen und Abnahmen des Verhältnisses von v-SEP zu mCherry-Fluoreszenz (Abb. 1c und Zusatzvideo 1), die, wenn sie mit dem Zeitpunkt des Knospenaufgangs korrelierten (Abb. 1c; gestrichelte vertikale Linien), einmal pro Zellzyklus auftraten spät in der Mitose. Die mCherry-Fluoreszenz veränderte sich im Laufe des Bildgebungszeitraums minimal (Erweiterte Daten, Abb. 1a) und identische Ergebnisse wurden bei der alleinigen Abbildung von v-SEP beobachtet (Abb. 1 und Zusatzvideo 2). Um die Alkalisierungs- und Ansäuerungsereignisse innerhalb des Zellzyklus genauer zu bestimmen, markierten wir die Plasmamembran mit mRuby2, fusioniert mit den ersten 28 Resten der palmitoylierten Plasmamembran-assoziierten Phosphatase Psr1, und bildeten v-SEP und Psr1-mRuby2 in wachsenden Zellen ab. Mithilfe von Psr1-mRuby2 konnten wir die Initiierung neuer Tochterzellen (Extended Data Abb. 1b; gestrichelte grüne vertikale Linien) und die Zelltrennung (Extended Data Abb. 1b; gestrichelte rote vertikale Linien) im Verhältnis zu v-SEP-Intensitätsänderungen (Extended Data Abb . 1b; schwarze Linie). Wir quantifizierten den Zeitpunkt über 14 Zellzyklusereignisse hinweg vom Knospenaufgang bis zur höchsten vakuolären Alkalisierung (59,4 ± 4,6 Minuten) und den Zeitpunkt von der höchsten vakuolären Alkalisierung bis zur Zelltrennung (5,7 ± 1,4 Minuten). Um zu testen, ob das Fortschreiten des Zellzyklus für die oszillierende vakuoläre pH-Dynamik wichtig ist, haben wir MATa-Zellen in G1 mit ɑ-Faktor8 angehalten und nach dem Stillstand des Zellzyklus keine Schwingungen beobachtet (Extended Data Abb. 1c; rote gestrichelte Linie zeigt Zelltrennung, blaue gestrichelte Linie zeigt). Zellzyklusstillstand). Diese Analyse zeigt, dass die oszillierende vakuoläre pH-Dynamik ein Fortschreiten des Zellzyklus erfordert und dass die vakuoläre Alkalisierung kurz vor der Zelltrennung in der späten Anaphase/Telophase ihren Höhepunkt erreicht.

Um festzustellen, ob das Mikrofluidikgerät die vakuoläre pH-Dynamik beeinflusst, wurden Zellen in Batch-Kultur in SDC-Medium gezüchtet und direkt auf Deckgläsern abgesetzt. v-SEP wurde etwa 400 Minuten lang oder etwa vier Zellteilungen lang abgebildet. Unter diesen Bedingungen beobachteten wir eine identische Dynamik des v-SEP-Reporters (Extended Data Abb. 1d und Zusatzvideo 3), was darauf hindeutet, dass das Mikrofluidikgerät das Oszillationsverhalten nicht verursacht hat. Wir haben auch festgestellt, ob Zellüberfüllung und lokaler Nährstoffmangel im Mikrofluidikgerät die vakuoläre pH-Dynamik beeinflussen könnten. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine speziell angefertigte Mikrofluidikplattform9, bei der einzelne Zellen in einzelnen Zellfängern gefangen wurden und Tochterzellen unter konstantem Mediumfluss weggespült wurden. Ratiometrische Fluoreszenzdaten (v-SEP/mCherry), die über ca. 1.000 Minuten erfasst wurden, wurden mit dem ersten identifizierten vakuolären Alkalisierungsereignis in 1.417 Einzelzellen abgeglichen (Abb. 1d). Wir beobachteten starke Schwankungen unter diesem experimentellen Regime, was die Schlussfolgerung untermauert, dass weder das Mikrofluidikgerät noch die Zellüberfüllung/Nährstoffmangel die vakuoläre pH-Dynamik in unseren Experimenten beeinflussen.

Als nächstes untersuchten wir die vakuoläre pH-Dynamik mit zwei zusätzlichen, unabhängigen Ansätzen. Zunächst verwendeten wir die zeitaufgelöste Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie (FLIM), um die pH-abhängigen Änderungen in der Fluoreszenzlebensdauer von auf Vakuolen gerichtetem mScarlet (v-mScarlet) zu messen. Die Fluoreszenzlebensdauer von mScarlet hängt empfindlich von seinem lokalen pH-Wert ab, ist jedoch unempfindlich von der lokalen Ionenzusammensetzung und der Fluorophorkonzentration10. Änderungen der Fluoreszenzlebensdauer zeigten eine sehr ähnliche Alkalisierungs- und Rücksäuerungsdynamik in der Vakuole, wie sie beim v-SEP-Reporter beobachtet wurde (Extended Data Abb. 1e und Zusatzvideo 4).

Zweitens verwendeten wir den durch Vakuolen sequestrierten pH-empfindlichen, ratiometrischen Farbstoff BCECF4,5. Zellen wurden in SDC gezüchtet, mit BCECF in demselben Medium behandelt und dann im Laufe der Zeit im Mikrofluidikgerät unter Verwendung von pH-empfindlicher Anregung, pH-unempfindlicher Anregung und Hellfeld abgebildet (Abb. 1e und Zusatzvideo 5). Diese Analyse ergab auch eine oszillierende pH-Dynamik (Abb. 1f). Mithilfe einer Kalibrierungskurve haben wir die pH-Änderungen über 129 Zellzyklusereignisse für 27 Zellen quantifiziert. Der niedrigste pH-Wert über die Zellzyklen hinweg war relativ konstant bei 5,82 (95 %-Konfidenzintervall (KI) 5,81–5,83) (Abb. 1g; schwarze Punkte), während die Spitzenalkalisierungsereignisse im Durchschnitt variabler waren und einen durchschnittlichen pH-Wert von 6,20 (95 %-KI) aufwiesen 6.18–6.23) (Abb. 1g; blaue Punkte). Die durchschnittliche pH-Änderung pro Zellzyklus betrug 0,38 pH-Einheiten (95 % KI, 0,36–0,41) (Abb. 1h).

Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass v-SEP Änderungen des vakuolären pH-Werts genau meldet. Daher unterliegen Vakuolen in Zellen, die in einer konstant definierten Wachstumsumgebung wachsen, die Glucose und Aminosäuren enthält, entweder in Batch-Kulturen oder in Mikrofluidikgeräten, einmal pro Zellzyklus regelmäßigen oszillierenden Alkalisierungs- und Ansäuerungsereignissen (Abb. 1i).

Der pH-Wert der Vakuole reagiert auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung. Um daher vakuoläre pH-Schwankungen in Zellpopulationen zu vergleichen, die in verschiedenen Wachstumsumgebungen und mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund wachsen, haben wir den Zeitraum (die Häufigkeit der Alkalisierung) und das Ausmaß der vakuolären pH-Änderungen in einzelnen Zellen quantifiziert, die sich über wiederholte Zellzyklen entwickeln. Wir haben automatisierte Merkmalssegmentierung und -verfolgung angewendet, um die zeitlich aufgelösten Fluoreszenzintensitätsänderungen von v-SEP in einzelnen Vakuolen zu extrahieren, während diese mindestens fünf Zellteilungen durchlaufen. Die Trajektorien wurden Fourier-transformiert, um die spektrale Leistungsdichte (PSD) der Zeitreihendaten von in SDC gezüchteten Wildtyp-Zellen zu erhalten (Abb. 2a; obere Kurve). In dieser Situation ist die Leistung proportional zur Fluoreszenzintensität (oszillierende vakuoläre pH-Amplitude) über einen bestimmten Zeitbereich. Die Frequenz mit der größten Leistung gibt die dominante pH-Oszillationsfrequenz an. Wir haben den Median der Amplituden bei der dominanten Frequenz für etwa 300 Zellen berechnet, die in den Mikrofluidikgeräten wachsen. Diese Zellen hatten eine vakuoläre pH-Amplitude von 9.900 willkürlichen Einheiten (AU) (95 %-KI 9.100–11.000) und eine mittlere Periodizität von 84,9 Minuten (95 %-KI 84,1–85,9, Wilcoxon-Signed-Rank-Test) (Abb. 2b; +AA). +Glukose). Diese Daten stimmen mit Schwankungen überein, die unter diesen Wachstumsbedingungen einmal pro Zellzyklus auftreten.

a, Ein Schema der PSD-Pipeline zur Umwandlung von v-SEP-Intensitätszeitreihendaten von in SDC (oben) oder YNBD (unten) gezüchteten Zellen in Amplituden-Frequenz-Diagramme. Die dominante Amplitude ist proportional zum Ausmaß der oszillierenden pH-Änderungen über den Bildgebungszeitraum (oszillierende vakuoläre pH-Amplitude). b: Die oszillierende vakuoläre pH-Amplitude wurde unter Verwendung der PSD-Pipeline für 339 in SDC (+Aminosäuren (AA) + Glucose) gezüchtete Zellen, 133 in SCEG (+AA, +Ethanol/Glycerin) gezüchtete Zellen und 321 in YNBD gezüchtete Zellen erhalten ( −AA, +Glukose). Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm angezeigt, wobei die Whisker als 1,5-facher Interquartilbereich berechnet werden, die Medianwerte durch den horizontalen roten Balken angezeigt werden und die P-Werte durch einen zweiseitigen Dunn-Test mit Holm-Anpassung berechnet werden. Die unter den Balkendiagrammen eingefügten Zahlen geben die mittlere Periode der vakuolären pH-Schwankungen an. c: In YNBD gezüchtete Zellen werden 1.000 Minuten lang alle 2 Minuten in Mikrofluidikkammern (CellASIC) abgebildet. Die v-SEP-Intensität über die Zeit wird für zwei repräsentative Zellen angezeigt. Vertikale gestrichelte Linien zeigen den Zeitpunkt des Knospenaufgangs an. d, Oszillierende vakuoläre pH-Amplitude von Zellen, die in Gegenwart einzelner Aminosäurezusätze gezüchtet wurden. Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm dargestellt, wobei die Whisker als 1,5-facher Interquartilbereich berechnet werden und die Medianwerte durch den horizontalen schwarzen Balken angezeigt werden. Beachten Sie, dass die Y-Achse auf 30.000 AE festgelegt ist. Bei der Analyse verwendete Zellzahl und Periodizität vakuolärer pH-Schwankungen in Minuten für jede Bedingung: Lys (n = 255, 111 ± 3 Min.), His (n = 132, 110 ± 5 Min.), Gly (n = 92, 104 ± 10 min), Pro (n = 26, 82 ± 18 min), Gln (n = 64, 96 ± 11 min), Ser (n = 60, 95 ± 8 min), Glu (n = 90, 87 ± 10 min ), Thr (n = 54, 91 ± 13 min), Arg (n = 280, 110 ± 3 min), Val (n = 56, 106 ± 10 min), Asn (n = 163, 105 ± 3 min), Asp (n = 102, 100 ± 10 Min.), Ile (n = 420, 98 ± 2 Min.), Trp (n = 121, 112 ± 4 Min.), Leu (n = 356, 104 ± 2 Min.), Ala ( n = 157, 97 ± 3 min), Phe (n = 429, 90 ± 2 min) und Tyr (n = 334, 101 ± 2 min). e: In SCEG gezüchtete Zellen werden 1.000 Minuten lang alle 2 Minuten in Mikrofluidikkammern (CellASIC) abgebildet. Die v-SEP-Intensität über die Zeit wird für zwei repräsentative Zellen angezeigt. Gestrichelte Linien zeigen den Zeitpunkt des Knospenaufgangs an. Weitere Kurven finden Sie unter Quelldaten.

Quelldaten

Um festzustellen, ob die oszillierende pH-Dynamik für den hier untersuchten Stamm einzigartig war, wurde die Analysepipeline verwendet, um die v-SEP-Fluoreszenzdynamik in zwei verschiedenen, aber häufig verwendeten Laborstämmen, W303 und BY4741, zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass beide eine robuste zellzyklusbedingte oszillatorische pH-Dynamik mit ähnlicher Amplitude und Periode aufwiesen (Extended Data Abb. 2a).

Die Vakuole ist ein zentraler Integrator der extrazellulären Nährstoffverfügbarkeit und ein wichtiger Ort der Aminosäurespeicherung1. Dies veranlasste uns zu untersuchen, ob extrazelluläre Aminosäuren die oszillierende vakuoläre pH-Dynamik beeinflussen. Zu diesem Zweck wurden Wildtyp-Zellen in einem Medium kultiviert, das Glukose, Salze und essentielle Nährstoffe, aber keine Aminosäuren (YNBD) enthielt. Anschließend wurde die vakuoläre pH-Dynamik mit dem v-SEP-Reporter untersucht. Im Gegensatz zu in SDC gezüchteten Zellen, die eine vollständige Ergänzung der exogen zugeführten Aminosäuren bieten (Abb. 1c), durchliefen in YNBD gezüchtete Zellen keine klaren und anhaltenden oszillierenden vakuolären Alkalisierungs- und Ansäuerungszyklen (Abb. 2c und Zusatzvideo 6). Stattdessen beobachteten wir einen langsamen progressiven Anstieg der v-SEP-Intensität, während die Zellen wiederholte Zellteilungen durchliefen; Es ist nicht bekannt, warum dieser Anstieg auftritt. Darüber hinaus durchliefen die Vakuolen stochastische Alkalisierungs- und Rücksäuerungsimpulse, die offenbar mit keinem Stadium des Zellzyklus verknüpft waren. Das Fehlen einer regulären Oszillationsdynamik wurde durch die PSD-Analyse gestützt (Abb. 2a; untere Spur), die zeigte, dass das Oszillationsverhalten von v-SEP für in YNBD gezüchtete Zellpopulationen geringfügig über dem Hintergrund lag (Abb. 2b; −AA + Glucose). . Darüber hinaus verliefen diese stochastischen Alkalisierungs- und Wiederversauerungsereignisse deutlich schneller als in der DEZA. Die mittlere halbmaximale Peakbreite der im alkalischen Zustand verbrachten Zeit betrug durchschnittlich 2 Minuten bei YNBD (Grenze der Zeitauflösung für die Experimente) gegenüber 11 Minuten bei SDC.

Der deutliche Unterschied in der Amplitude der oszillierenden vakuolären pH-Dynamik zwischen Zellen, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Aminosäuren gezüchtet wurden, veranlasste uns zu der Frage, ob einzelne Aminosäuren oder Klassen von Aminosäuren zu dieser Dynamik beitragen. Zu diesem Zweck wurden Zellen in YNBD gezüchtet, denen einzelne Aminosäuren in den in SDC gefundenen Konzentrationen zugesetzt wurden, und die Amplitude der Oszillationsdynamik der Zellpopulation wurde mithilfe der PSD-Analyse bewertet. Wie bereits berichtet, verursachte Cystein allein ein langsames Zellwachstum11,12 und in unseren Händen verursachte frisch zubereitetes Methionin allein auch Wachstumsstörungen, sodass sie bei der weiteren Analyse nicht berücksichtigt wurden. Für die übrigen Aminosäuren beobachteten wir eine abgestufte Reaktion in der oszillierenden vakuolären pH-Amplitude. Einige, wie Lysin, Glycin, Histidin und Prolin, waren kaum in der Lage, vakuoläre pH-Schwankungen zu induzieren (Abb. 2). Im Gegensatz dazu neigten die aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin sowie die verzweigtkettigen Aminosäuren Leucin und Alanin dazu, starke vakuoläre pH-Schwankungen auszulösen (Abb. 2), während alle anderen Aminosäuren mittlere Reaktionen hervorriefen (Abb. 2d).

Während unserer Experimente zur Aminosäureergänzung stellten wir fest, dass einige Aminosäuren wie Tryptophan und Glutamin dazu führten, dass Zellen längere bzw. kürzere Perioden vakuolärer pH-Schwankungen aufwiesen, was die Möglichkeit erhöht, dass die Wachstumsrate das Ausmaß der vakuolären pH-Änderungen beeinflussen könnte. Um zu testen, ob die Zellwachstumsrate und Änderungen in der Schwankungsperiode des vakuolären pH-Werts die Stärke der Schwankungen beeinflussen könnten, haben wir die Periode der Schwankungen des vakuolären pH-Werts im Verhältnis zu ihrer Stärke für alle in diesem Manuskript getesteten Wachstumsbedingungen und Mutanten (unten beschrieben) aufgetragen und festgestellt Keine Korrelation zwischen den beiden Parametern (Extended Data Abb. 2b), was darauf hindeutet, dass die Wachstumsrate keinen Einfluss auf das Ausmaß der vakuolären pH-Änderungen hat.

Glykolytische und respiratorische Kohlenstoffquellen sind gut dokumentierte Regulatoren des vakuolären pH13. Daher haben wir untersucht, ob die Kohlenstoffquelle die vakuoläre pH-Dynamik während des Zellzyklus beeinflusst. Die Zellen wurden in einem Medium gezüchtet, das alle Aminosäuren und Ethanol/Glycerin (SCEG), eine respiratorische Kohlenstoffquelle, enthielt. Auf Populationsebene (18.000 AU, 95 % KI 14.000–22.000, n = 133 Zellen) kam es im Vergleich zu in Glucose gezüchteten Zellen zu einem ca. 1,8-fachen Anstieg der oszillierenden vakuolären pH-Amplitude (Abb. 2b; vergleiche +AA). +Ethanol/Glycerin zu +AA +Glukose; und Zusatzvideo 7). Einzelne v-SEP-Intensitätsspuren zeigten leicht erkennbare zellzyklusbedingte Oszillationen mit erhöhter Amplitude und erhöhter Grundintensität im Vergleich zu Zellen, die in Gegenwart von Glucose gezüchtet wurden (Abb. 2e; vergleichen Sie repräsentative Kurven in Abb. 1 (v-SEP.SDC) mit Abb. 2 (v-SEP.SCEG)). Dies steht im Einklang mit Daten, die darauf hindeuten, dass die Verfügbarkeit glykolytischer Kohlenstoffquellen ein wichtiger Regulator des vakuolären pH-Werts13 ist.

Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Amplitude der vakuolären pH-Schwankungen durch die Verfügbarkeit aromatischer und verzweigtkettiger Aminosäuren und die Fermentations- oder Atmungskapazität der zugeführten Kohlenstoffquelle moduliert wird.

Um zelluläre Signalwege zu identifizieren, die möglicherweise erhöhte extrazelluläre verzweigtkettige und aromatische Aminosäuren wahrnehmen und darauf reagieren, analysierten wir die Transkriptionssignatur von Zellen, die in Gegenwart von Tyrosin oder Leucin gezüchtet wurden, mittels RNA-seq. Wie bereits gezeigt14, reagierten Zellen auf extrazelluläre aromatische und verzweigtkettige Aminosäuren, indem sie die Expression von Aminosäurepermeasen durch die Wirkung der SPS-Reaktion hochregulierten (Extended Data, Abb. 3a). Die SPS-Reaktion wird von einem Sensormodul an der Plasmamembran gesteuert, das aus Ssy1, Ptr3 und Ssy5 besteht und zwei Transkriptionsfaktoren, Stp1 und Stp215, aktiviert. Die SPS-Reaktion induziert die Synthese von etwa zehn Aminosäurepermeasen, die den Aminosäureimport in die Zelle steuern16. Um die Rolle der SPS-Reaktion und des Aminosäureimports bei der Regulierung des vakuolären pH-Werts zu testen, haben wir die oszillierende vakuoläre pH-Amplitude in Zellen quantifiziert, denen in SDC gewachsene SPS-Reaktionskomponenten fehlen (Abb. 3a). Bei jeder Mutante beobachteten wir eine mehr als zweifache Verringerung der oszillierenden vakuolären pH-Amplitude im Vergleich zu Wildtyp-Zellen (Abb. 3a). Diese Daten legen nahe, dass der Anstieg der intrazellulären Aminosäuren, der aus der SPS-Reaktion resultiert, wichtig ist, um die oszillierende pH-Dynamik in der Vakuole zu stimulieren.

a: Oszillierende vakuoläre pH-Amplitude von Wildtyp-Zellen und Zellen ohne die SPS-Komponenten Ptr3 (288 Zellen), Ssy1 (447 Zellen) und Ssy5 (399 Zellen), gezüchtet in SDC. Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm angezeigt, wobei die Whisker als 1,5-facher Interquartilbereich berechnet werden, die Medianwerte durch den horizontalen roten Balken angezeigt werden und die P-Werte durch einen zweiseitigen Dunn-Test mit Holm-Anpassung berechnet werden. Die unter den Balkendiagrammen eingefügten Zahlen geben die mittlere Periode der vakuolären pH-Schwankungen an. b: In SDC gezüchtete Zellen werden 1.000 Minuten lang alle 2 Minuten in Mikrofluidikkammern (CellASIC) abgebildet und im Gerät mit Rapamycin behandelt (vertikaler roter Balken). Die v-SEP-Intensität über die Zeit wird für zwei repräsentative Zellen angezeigt. c: In SDC gezüchtete Zellen werden 1.000 Minuten lang alle 2 Minuten in Mikrofluidikkammern (CellASIC) abgebildet und im Gerät mit ConcA (vertikaler roter Balken) behandelt. Die v-SEP-Intensität über die Zeit wird für zwei repräsentative Zellen angezeigt. Gestrichelte Linien zeigen den Zeitpunkt des Knospenaufgangs an. d, Oszillatorische vakuoläre pH-Amplitude von WT-Zellen und Zellen, denen die Fab1-Komponenten Vac7 (177 Zellen), Vac14 (287 Zellen), Atg18 (200 Zellen), Fab1 (21 Zellen) und Fig4 (206 Zellen) fehlen, gewachsen in SDC. Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm angezeigt, wobei die Whisker als 1,5-facher Interquartilbereich berechnet werden, die Medianwerte durch den horizontalen roten Balken angezeigt werden und die P-Werte durch einen zweiseitigen Dunn-Test mit Holm-Anpassung berechnet werden. Die unter den Balkendiagrammen eingefügten Zahlen geben die mittlere Periode der vakuolären pH-Schwankungen an. e, Oszillatorische vakuoläre pH-Amplitude von Wildtyp-Zellen und Zellen, denen das CDK5-Homolog Pho85 (201 Zellen) und die assoziierten Cycline Pho80 (240 Zellen), Pcl6 (315 Zellen), Pcl7 (277 Zellen) und die Doppelmutante Pcl6 und Pcl7 fehlen ( 206 Zellen). Die Zellen wurden in SDC gezüchtet. Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm angezeigt, wobei die Whisker als 1,5-facher Interquartilbereich berechnet werden, die Medianwerte durch den horizontalen roten Balken angezeigt werden und die P-Werte durch einen zweiseitigen Dunn-Test mit Holm-Anpassung berechnet werden. Die unter den Balkendiagrammen eingefügten Zahlen geben die mittlere Periode der vakuolären pH-Schwankungen an. f, Oszillatorische vakuoläre pH-Amplitude von WT-Zellen und Zellen, denen sieben mutmaßliche Pho85-Phosphostellen in Vac7 (vac7-7A, 228 Zellen) und 21 mutmaßliche Phosphostellen in Fab1 (fab1-21A, 168 Zellen) und der Doppelmutante (vac7) fehlen -7A fab1-21A, 257 Zellen). Die Zellen wurden in SDC gezüchtet. Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm angezeigt, wobei die Whisker als 1,5-facher Interquartilbereich berechnet werden, die Medianwerte durch den horizontalen roten Balken angezeigt werden und die P-Werte durch einen zweiseitigen Dunn-Test mit Holm-Anpassung berechnet werden. Die unter den Balkendiagrammen eingefügten Zahlen geben die mittlere Periode der vakuolären pH-Schwankungen an. Weitere Kurven finden Sie unter Quelldaten.

Quelldaten

Um einen molekularen Zusammenhang zwischen Veränderungen in der Verfügbarkeit verzweigtkettiger und aromatischer Aminosäuren im Zytoplasma und der oszillierenden vakuolären pH-Amplitude zu identifizieren, haben wir den Beitrag zur Induktion vakuolärer pH-Schwankungen durch die beiden wichtigsten zytoplasmatischen Aminosäure-Sensorwege getestet: allgemeine Aminosäurekontrolle und TORC115,17. Während die Deletion der eIF2-Kinase GCN2 keinen Einfluss auf die pH-Dynamik der oszillierenden Vakuole hatte (Erweiterte Daten, Abb. 3b), hatte die pharmakologische Hemmung der TORC1-Signalübertragung durch Rapamycin-Behandlung von Zellen einen starken Effekt (Abb. 3b; Zeitpunkt der Rapamycin-Zugabe markiert durch). rote vertikale Linie; Zusatzvideo 8).

Die TORC1-Signalisierung integriert den zellulären Ernährungsstatus mit der Speicherung von Vakuolen-/Lysosom-Metaboliten durch die v-ATPase-Funktion in Hefe- und Säugetierzellen2. Darüber hinaus ist die v-ATPase der Hauptregulator des vakuolären pH-Werts. Daher haben wir den Beitrag der v-ATPase zur oszillierenden vakuolären pH-Dynamik getestet, indem wir die vakuolenspezifische V0-Untereinheit der v-ATPase, Vph1, genetisch gelöscht haben. Wir haben, wie bereits berichtet, festgestellt, dass Zellen, denen Vph1 fehlt, stark fragmentierte Vakuolen aufweisen18; Diese stark fragmentierten Vakuolen in vph1∆-Zellen waren außergewöhnlich mobil und es war zu schwierig, sie über viele Stunden hinweg genau zu verfolgen und zu quantifizieren. Um diese Herausforderung zu umgehen, haben wir die direkte Rolle der v-ATPase getestet, indem wir Zellen mit dem pharmakologischen v-ATPase-Inhibitor Concanamycin A (ConcA) behandelt haben. Nach dem Wechsel zu Wachstumsmedium, das den v-ATPase-Inhibitor enthält (Abb. 3c, Zeitpunkt der ConcA-Zugabe markiert durch rote vertikale Linie und Zusatzvideo 9), nahm die Fluoreszenzintensität von v-SEP zunehmend zu, was auf eine vakuoläre Alkalisierung und einen Verlust der oszillierenden pH-Dynamik hinweist . Bemerkenswert ist, dass der Anstieg der Fluoreszenz des v-SEP-Reporters der in vph1∆-Zellen beobachteten Fragmentierung vorausging, was eine genaue Verfolgung und Quantifizierung von v-SEP-Fluoreszenzänderungen ermöglichte. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die v-ATPase ein wichtiger Faktor für zellzyklusbedingte pH-Schwankungen in der Vakuole ist.

Um die Inputs zu untersuchen, die möglicherweise die Regulierung der v-ATPase- und TORC1-Aktivität koppeln, untersuchten wir die Rolle des vakuolenspezifischen Lipids PtdIns(3,5)P2 bei der oszillierenden vakuolären pH-Dynamik. PtdIns(3,5)P2 ist ein auf Stress reagierendes Minderheitsphosphoinositol-Lipid der Vakuole. Es wird vom Fab1-Kinasekomplex (PIKfyve bei Säugetieren) produziert, der Fab1, Vac7 und Vac14 enthält und durch Fig4 und Atg1819 negativ reguliert wird. PtdIns(3,5)P2 interagiert mit dem v-ATPase-Holoenzym in osmotisch gestressten Zellen und stabilisiert es. Außerdem spielt es eine Rolle bei der Regulierung der TORC1-Signalübertragung bei Ernährungsstress19. Der Fab1-Komplex wird auch reziprok durch TORC120 reguliert, was die Produktion von PtdIns(3,5)P2 zu einem potenziell wichtigen regulatorischen Knotenpunkt für die Koordinierung der vakuolären pH-Dynamik und der Aminosäureerkennung macht. Während vermutet wird, dass der Fab1-Komplex den vakuolären pH-Wert in nicht gestressten, schnell wachsenden Zellen nicht beeinflusst21, wurde die Dynamik der pH-Regulierung bei Fab1-Mutanten auf Einzelzellebene nicht untersucht. Die genetische Deletion von Vac7, Vac14, Atg18 und Fab1 hatte einen starken Einfluss auf die Amplitude der oszillierenden pH-Dynamik in Gegenwart extrazellulärer Aminosäuren im Vergleich zu Wildtyp-Zellen (Abb. 3d). Bemerkenswert ist, dass die Deletion von Abb. 4, einer Phosphatase, von der angenommen wird, dass sie als wichtiger Regulator des Komplexes fungiert, im Vergleich zu Wildtyp-Zellen in SDC eine etwas höhere oszillierende vakuoläre pH-Amplitude aufwies (Abb. 3d). Diese Daten legen nahe, dass die Produktion von PtdIns(3,5)P2 für die Modulation der oszillierenden vakuolären pH-Dynamik wesentlich ist und dass die Regulierung des Fab1-Komplexes durch Abb.4 nicht unbedingt erforderlich ist, sondern eine differenziertere regulatorische Rolle spielt.

a, Einzelbilder aus der Zeitrafferaufnahme von mCherry-Atg18 und v-SEP während einer Runde der vakuolären Alkalisierung, hervorgehoben durch gestrichelte Linien im Zeitreihendiagramm unten. Das untere Zeitreihendiagramm zeigt die mCherry-Atg18-Intensität an der Vakuolenoberfläche und die lumenale v-SEP-Intensität über mehrere Zellteilungsereignisse hinweg. Peak-v-SEP-Signale werden durch eine durchgezogene graue Linie hervorgehoben. b, Ein Modell zeigt die molekularen Akteure, die an der Regulierung des vakuolären pH-Werts beteiligt sind, wenn WT-Zellen in Gegenwart von Alanin, verzweigtkettigen und aromatischen Aminosäuren wachsen. Die pH-Regulierung erfordert eine Pho85/Pcl6/Pcl7-abhängige Stimulation des Fab1-Komplexes (PIKfyve bei Säugetieren), um PtdIns(3,5)P2 (PI(3,5)P2) zu produzieren, das Atg18 rekrutiert und TORC1 und den v- ATPase. Während des Wachstums sinken die PtdIns(3,5)P2-Spiegel an der Vakuole, was wiederum zu einer Herunterregulierung von TORC1 und v-ATPase führen kann, was zu einem Anstieg des vakuolären pH-Werts führt. Weitere Kurven finden Sie unter Quelldaten.

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Die PtdIns(3,5)P2-Produktion während osmotischem Stress ist durch die Aktivität des nährstoffresponsiven CDK-Cyclin-Paares Pho85–Pho8019 mit der Signalübertragung der Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) verbunden. Pho85–Pho80 phosphoryliert den Fab1-Komplex direkt und reguliert positiv seine Aktivität19. Um zu testen, ob die CDK-Signalübertragung die oszillierende vakuoläre pH-Dynamik beeinflusst, haben wir die Amplitude der pH-Oszillationen in Zellen ohne Pho85 und Pho80 quantifiziert. Die pho85∆-Zellen wiesen stark reduzierte Oszillationen auf, wohingegen die Oszillationen in pho80∆-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen (Abb. 3e) nicht wesentlich reduziert waren (Abb. 3e), was darauf hindeutet, dass, ähnlich wie im obigen Beispiel in Abb. 4 für den Fab1-Komplex, Aspekte der PtdIns(3,5)P2-Regulation während des Zellwachstums ohne Stress unterscheiden sich von denen während des osmotischen Stresses. Pho85 hat zehn Cyclin-Partner (Pho80, Clg1, Pcl1, Pcl2, Pcl5, Pcl6, Pcl7, Pcl8, Pcl9 und Pcl10), die aus paralogen Cyclin-Paaren mit redundanten Funktionen bestehen23. Wir fanden heraus, dass Pcl6 und Pcl7 jeweils zu vakuolären pH-Schwankungen beitrugen (Abb. 3e). Durch die Löschung von Pcl6 und Pcl7 (Abb. 3e) wurde die Amplitude der oszillierenden vakuolären pH-Dynamik weiter auf die in pho85∆-Zellen beobachtete reduziert.

Pho85 soll Fab1 und Vac7 phosphorylieren, um deren Aktivität zu regulieren19. Um die Bedeutung der Pho85-abhängigen Phosphorylierung von Fab1 und Vac7 für die vakuoläre pH-Dynamik zu testen, haben wir die Amplitude der pH-Oszillationen in zuvor beschriebenen Mutanten von Fab1 ohne 21 mutmaßliche Pho85-Phospho-Stellen (fab1-21A) und Vac7 ohne 7 mutmaßliche Pho85-Phospho-Stellen quantifiziert -Standorte (vac7-7A)19. Vac7-7A-Mutantenzellen wiesen leicht verringerte vakuoläre pH-Schwankungen auf, wohingegen Fab1-21A-Mutantenzellen ein stärkeres Defizit aufwiesen (Abb. 3f). Die Doppelmutante reduzierte die oszillierende vakuoläre pH-Amplitude weiter auf die in den pcl6∆pcl7∆- und pho85∆-Zellen beobachtete Amplitude (Abb. 3f).

Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass es sich bei Pcl6 und Pcl7 um zwei Cycline handelt, die über die Pho85-Kinase redundant wirken, um die mit dem Zellzyklus verbundene oszillierende vakuoläre pH-Dynamik zu regulieren, höchstwahrscheinlich durch Phosphorylierung von Fab1 und Vac7.

Die bisherigen Daten deuten auf ein Modell hin, bei dem Pho85/Pcl6/Pcl7-abhängige Änderungen der Fab1-Aktivität die PtdIns(3,5)P2-Spiegel verändern, um die v-ATPase-Aktivität und die TORC1-Funktion zu beeinflussen. Bisher gibt es jedoch keinen Hinweis darauf, dass sich die PtdIns(3,5)P2-Spiegel in der Vakuole während des Zellwachstums ändern, um eine solche regulatorische Kontrolle während des Zellzyklus zu bewirken. Die Messung von PtdIns(3,5)P2 in unbelasteten Zellen ist aufgrund seiner geringen Häufigkeit im Vergleich zum gesamten Phosphoinositol-Pool eine Herausforderung. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass die PtdIns(3,5)P2-Produktion unterschiedlich zwischen Signalendosomen und der Vakuole reguliert wird20, was Techniken zur Messung der gesamten zellulären PtdIns(3,5)P2-Spiegel ungeeignet macht, um die Dynamik dieses Lipids speziell an der Vakuole zu erfassen Vakuole. Atg18 ist eine wichtige regulatorische Komponente der PtdIns(3,5)P2-Erzeugung und gilt als PtdIns(3,5)P2-Sensorprotein. Es ist auch ein negativer Regulator des Fab1-Komplexes. Um die Akkumulation von PtdIns(3,5)P2 in der Vakuole zu untersuchen, haben wir die Dynamik von Atg18 zusammen mit dem v-SEP-Reporter überwacht. N-terminal markiertes mCherry-Atg18 zeigte eine klare vakuolenbegrenzende Membranlokalisation in Zellen mit sauren Vakuolen (Abb. 4a, oben links und Zusatzvideo 10); Als die Vakuolen jedoch weniger sauer wurden, wurde mCherry-Atg18 aus der Membran verdrängt und dann auf der Vakuolenoberfläche wieder zusammengesetzt, während der Säuregehalt wiederhergestellt wurde (Abb. 4a, oben in der Mitte und rechts, und Zusatzvideo 10). Die Quantifizierung von mCherry-Atg18 an der Vakuolenoberfläche im Verhältnis zur v-SEP-Fluoreszenz zeigt, dass Atg18 Rekrutierungs- und Verdrängungsrunden von der Vakuolenoberfläche durchläuft, die streng an Ansäuerungs- bzw. Alkalisierungsrunden gebunden sind (Abb. 4a, unteres Diagramm und erweitert). Daten Abb. 3c). v-ATPase-Aktivität und -Assemblierung werden durch PtdIns(3,5)P2 beeinflusst. Um zu testen, ob der zyklische PtdIns(3,5)P2-Spiegel in unbelasteten Zellen den v-ATPase-Assemblierungszustand beeinflusst, haben wir eine Untereinheit der peripheren V1-Domäne (Vma5) markiert und ihre Lokalisierung über einen Zellzyklus zusammen mit dem v-SEP-Reporter untersucht. Wir fanden keine Hinweise darauf, dass die V1-Domäne der v-ATPase auf der Ebene der Assemblierung an der Vakuolenoberfläche reguliert wird (Extended Data Abb. 3d). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die PtdIns(3,5)P2-Spiegel während des gesamten Zellzyklus zyklisch sind, und liefern Hinweise darauf, dass die PtdIns(3,5)P2-abhängige Regulierung der v-ATPase über das Niveau des Assemblierungsstatus/osmotischen Stresses hinaus wirkt und kann eine Rolle bei der Regulierung des vakuolären pH-Werts während des vegetativen Wachstums in nicht gestressten Zellen spielen (zusammengefasst in Abb. 4b).

Es wird angenommen, dass ein saurer vakuolärer pH-Wert für die Speicherung von Metaboliten wie Aminosäuren von wesentlicher Bedeutung ist1. Wir fragten uns, ob die dynamische CDK- und PtdIns(3,5)P2-abhängige Alkalisierung und Ansäuerung des Vakuolenkompartiments ausreichte, um die Konzentrationen der Vakuolenmetaboliten während des Zellwachstums zu verändern. Zu diesem Zweck verfolgten wir das Schicksal des Tryptophan-Analogons 4-Cyanotryptophan (4cnTrp) in Zellen24. 4cnTrp unterscheidet sich von Tryptophan durch zwei Atome, wird durch 355-nm-Licht angeregt, hat eine hohe Quantenausbeute und seine Fluoreszenzintensität ist unempfindlich gegenüber biologisch relevanten pH-Änderungen25, was es ideal für unsere Zwecke macht.

Wir haben zunächst bestätigt, dass 4cnTrp, synthetisiert durch eine manipulierte Variante von TrpB aus Thermotoga maritima26, keine Fluoreszenzänderungen im pH-Bereich von 5,5–7,0 zeigte (Extended Data Abb. 4). Anschließend fügten wir den Zellen 4cnTrp als einzige extrazelluläre Aminosäurequelle hinzu. Die Bildgebung von 4cnTrp und v-SEP zeigte, dass sich 4cnTrp in der Vakuole ansammelte und vakuoläre pH-Oszillationen stimulierte, genau wie Tryptophan (Abb. 5a, b, mikroskopische Aufnahmen und Diagramme: vor ConcA und Zusatzvideo 11). Bemerkenswert ist, dass die 4cnTrp-Akkumulation in der Vakuole oszillierend war und zunahm, wenn der pH-Wert der Vakuole am sauersten war (Abb. 5b, vor ConcA). Dies stand im Einklang mit der Vorstellung, dass der vakuoläre pH-Wert für die Akkumulation vakuolärer Metaboliten wesentlich ist. Um zu testen, ob der vakuoläre pH-Wert der Hauptfaktor für die Akkumulation und Retention von 4cnTrp in der Vakuole war, behandelten wir Zellen mit dem v-ATPase-Inhibitor ConcA und bildeten gleichzeitig v-SEP und 4cnTrp ab. Die Hemmung der v-ATPase führte zum schnellen Ausfluss von 4cnTrp aus der Vakuole, was mit der Alkalisierung der Organelle übereinstimmte (Abb. 5a, b, mikroskopische Aufnahmen und Diagramme: nach ConcA).

a, Einzelbilder aus der Zeitrafferaufnahme von 4cnTrp und v-SEP vor der ConcA-Behandlung (prä-ConcA) und nach der ConcA-Zugabe (post-ConcA). b: Vakuoläre v-SEP- und 4cnTrp-Fluoreszenzintensität über die Zeit sind in Grün bzw. Cyan dargestellt. Die vertikale rote Linie zeigt den Zeitpunkt der ConcA-Zugabe an. Beachten Sie, dass die v-SEP-Intensität in diesem Diagramm nicht mit den anderen v-SEP-Intensitätsdaten aus dem Rest des Manuskripts vergleichbar ist, da sie auf einem konfokalen Mikroskop mit unterschiedlichen Belichtungszeiten und einer anderen Kamera (Methoden) generiert wurden. Weitere Kurven finden Sie unter Quelldaten.

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Während unserer Charakterisierung vakuolärer pH-Änderungen stellten wir fest, dass es zu einer deutlichen Änderung des Brechungsindex und der scheinbaren Tonizität der Vakuole kam, die gleichzeitig mit dem Höhepunkt der vakuolären Alkalisierung auftrat (Abb. 1e, roter Pfeil und Zusatzvideo 5). Dies deutet auf eine Veränderung der Konzentration gelöster Stoffe in der Vakuole27 hin und kann auf einen Austausch gelöster Stoffe zwischen dem Zytoplasma und der Vakuole hinweisen, der mit Veränderungen des vakuolären pH-Werts einhergeht. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die vakuoläre pH-Dynamik ausreichend groß ist, um Metaboliten aus der Vakuole zu bewegen, und dass der vakuoläre pH-Gradient möglicherweise als molekularer Rheostat fungiert, der die Konzentrationen vieler gespeicherter Metaboliten in der Vakuole steuert.

Um die biologische Bedeutung der oszillierenden vakuolären pH-Dynamik und der Metabolitenfreisetzung besser zu verstehen, versuchten wir, ein gemeinsames phänotypisches Profil bei Mutanten zu identifizieren, denen vakuoläre pH-Schwankungen fehlten. Alle starken vakuolären pH-Oszillationsmutanten weisen ausgeprägte Defekte im Zellwachstum auf, mit Ausnahme von atg18∆, dem Regulator der mit dem Fab1-Komplex verbundenen PtdIns(3,5)P2-Dynamik. Um eine mögliche Pleiotropie aufgrund von Wachstumsdefiziten zu umgehen und die phänotypischen Folgen der Blockierung vakuolärer pH-Schwankungen einzugrenzen, führten wir eine RNA-Sequenz durch, um die Transkriptome von drei Stämmen zu vergleichen, die nicht in der Lage sind, den pH-Wert der Vakuolen zu schwingen, und die jeweils unterschiedliche Auswirkungen auf die Zellphysiologie haben. Wir verwendeten Stämme mit einer einzelnen Deletion der Fab1-Lipidkinase (fab1∆), dem negativen Regulator des Fab1-Komplexes (atg18∆) und der vakuolenspezifischen Untereinheit der v-ATPase (vph1∆). Wir führten eine Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) durch, um gemeinsame hoch- und herunterregulierte biochemische Pfade zu identifizieren 28 und identifizierten fünf signifikante co-hochregulierte und zwei co-herunterregulierte KEGG-Pfade, die von den Stämmen atg18∆, fab1∆ und vph1∆ gemeinsam genutzt werden (Abb. 6a). Die an den co-herunterregulierten Signalwegen beteiligten Gene bestanden aus zwei Klassen: der oxidativen Phosphorylierung und dem Ribosom. Die Herunterregulierung der oxidativen Phosphorylierung steht im Einklang mit früheren Berichten, die die v-ATPase und den Fab1-Komplex mit der Mitochondrienfunktion in Verbindung bringen29. Die Herunterregulierung ribosomaler Proteingene deutete darauf hin, dass Zellen, die nicht in der Lage waren, den vakuolären pH-Wert zu schwanken, proteotoxischen Stress30 und eine verringerte Translationskapazität31 erlebten.

a, Venn-Diagramme gemeinsamer co-upregulierter (orange) und co-downregulierter (blau) KEGG-Pfade, die durch GSEA-Analyse identifiziert wurden und die Transkriptome von fab1∆, atg18∆ und vph1∆ vergleichen. KEGG-Pfade werden im Tabellenformat mit P-Werten und normalisierten Anreicherungswerten (NES) für jede Mutante angezeigt. b, Vulkandiagramme der Transkriptionsänderungen in atg18∆-, vph1∆- und fab1∆-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Differenziell exprimierte Gene, q-Wert > 0,05, sind rot gefärbt und Arg1 ist grün hervorgehoben. c, Histogramme der Arg1-mNeon-Expression, analysiert durch Durchflusszytometrie, Vergleich der Arg1-Spiegel in Wildtyp- und atg18∆-Zellen in Medium, das Aminosäuren enthält (links, SDC, WT \(\underline{x}\) = 496,4 AU gegenüber atg18∆ \ (\underline{x}\) = 901,0 AU, zweiseitiger t-Test P < 2,2 × 10−16) und ohne Aminosäuren (rechts, YNBD, WT \(\underline{x}\) = 3.235,1 AU versus atg18 ∆ \(\underline{x}\) = 3.520,6 AE, zweiseitiger t-Test P < 2,2 × 10−16). d, Diagramm der oszillierenden vakuolären pH-Amplitude einer einzelnen Aminosäure (aus Abb. 2d) gegenüber der fachen Arg1-mNeon-Induktion in atg18∆-Zellen relativ zur WT. Fehlerbalken stellen ein 95 %-KI dar.

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Eine Untersuchung der co-hochregulierten Gene legte nahe, dass mehrere biochemische Wege im Zusammenhang mit der Produktion von Metaboliten induziert wurden (Abb. 6a). Erstens wurde die Hochregulierung der Gene des Stärke- und Saccharosestoffwechsels größtenteils durch Gene vorangetrieben, die am Glykogenstoffwechsel beteiligt sind und deren Transkription durch die Verfügbarkeit von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen gesteuert wird32. Die letzten vier Klassen co-hochregulierter KEGG-Signalwege konzentrierten sich alle auf den Stickstoffstoffwechsel, wobei die Gene ARG1 und ARG3 einen wesentlichen Beitrag zu jeder angereicherten Klasse leisteten. Die Analyse der differentiellen Expression hob die relativ geringen globalen Transkriptionsänderungen in atg18∆ im Vergleich zu fab1∆ und vph1∆ hervor, zeigt jedoch, dass Arg1 eines der am stärksten hochregulierten Gene in allen drei Deletionsmutanten war (Abb. 6b). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass einer der gemeinsamen Phänotypen für Zellen, die nicht in der Lage sind, den vakuolären pH-Wert zu schwanken, ein wahrgenommenes Stickstoffungleichgewicht und die Hochregulierung der Arginin-Biosynthesegene ist.

Atg18 ist ein wichtiger Bestandteil der autophagischen Maschinerie, der zusammen mit Atg2 eine Schlüsselrolle bei der Expansion der Autophagosomen spielt33. Wir haben uns gefragt, ob eine fehlerhafte Autophagie möglicherweise eine Rolle bei der Hochregulierung von ARG1 und ARG3 in atg18∆-Zellen spielt. Um dies zu untersuchen, analysierten wir zuvor veröffentlichte Boten-RNA-Expressionsdaten von 1.484 Knockout-Hefestämmen34 erneut und extrahierten mRNA-Faltungsänderungen in Autophagie-Knockout-Stämmen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen, wobei wir uns auf Transkriptionsänderungen in Arginin-Biosynthesegenen konzentrierten. Diese Daten zeigen keine signifikanten Veränderungen in der ARG1- oder ARG3-mRNA in 23 Stämmen, denen Schlüsselkomponenten des Autophagieprozesses fehlen (Extended Data Abb. 5a), was darauf hindeutet, dass atg18∆-Zellen ARG1 und ARG3 hochregulieren, was unabhängig von Defekten in der Autophagie ist.

Der Arginin-Biosyntheseweg zeichnet sich durch die direkte Regulierung durch Arginin auf Enzymebene, Transkriptionsebene und Translationsebene aus35. Die ersten fünf Schritte der Arginin-Biosynthese finden im Mitochondrium statt, während die letzten drei Schritte, katalysiert durch Arg1, Arg3 und Arg4, im Zytoplasma stattfinden. Die zentrale Rolle von Arginin im Stickstoffstoffwechsel, seine starke Akkumulation in der Vakuole und die Hochregulierung wichtiger zytoplasmatischer Akteure bei der Arginin-Biosynthese führten uns zu der Frage, ob vakuoläre pH-Schwankungen für die Versorgung des Zytoplasmas mit Arginin unter Bedingungen eines Überschusses an Alanin, aromatischen oder verzweigten Argininen wichtig sind. Kettenaminosäuren. Um zu sehen, ob die Transkriptionsinduktion dieser wichtigen zytoplasmatischen Enzyme auf Proteinebene rekapituliert wurde, markierten wir ARG1 und ARG3 mit mNeon. Insbesondere atg18∆-Zellen wurden aufgrund ihres relativ harmlosen Wachstumsphänotyps analysiert. Wir fanden heraus, dass Arg1 in atg18∆-Zellen, die unter Bedingungen gezüchtet wurden, unter denen normalerweise vakuoläre pH-Schwankungen induziert wurden, tatsächlich um das ~1,8-fache hochreguliert war (Abb. 6c, SDC). Eine ähnliche, jedoch weniger ausgeprägte (1,3-fache) Hochregulierung von Arg3 wurde ebenfalls beobachtet (Extended Data Abb. 5b). In Medium ohne Aminosäuren (YNBD), in dem Arg1 bereits stark exprimiert wird, kam es in atg18∆-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen nur zu einer geringfügigen (1,1-fachen) Hochregulierung von Arg1 (Abb. 6c).

Wir fragten dann, ob die Hochregulierung von Arg1 in atg18∆ durch bestimmte Aminosäuren induziert wurde. Wir fanden heraus, dass für jede einzelne hinzugefügte Aminosäure das Ausmaß der Induktion von Arg1 in atg18∆ im Vergleich zu Wildtyp-Zellen mit der entsprechenden oszillierenden vakuolären pH-Amplitude korreliert. Diese Analyse ergab eine klare Korrelation, bei der Alanin, aromatische und verzweigtkettige Aminosäuren einzeln die stärkste Induktion von Arg1 erzeugten (Abb. 6d), während alle Aminosäuren (SDC) zusammen die maximale Induktion erzeugten. Dies legt nahe, dass die Aminosäuren, die die Arg1-Expression in atg18∆ induzieren, dieselben sind, die vakuoläre pH-Oszillationen induzieren, und dass es einen additiven Effekt aller Aminosäuren auf die Arg1-Induktion gibt.

Aufgrund dieser Ergebnisse schlagen wir vor, dass Zellen vakuoläre pH-Schwankungen nutzen, um ihre Arginin-Biosynthesekapazität als Reaktion auf Veränderungen in der Verfügbarkeit von zytoplasmatischem Alanin, verzweigtkettigen und aromatischen Aminosäuren fein abzustimmen. Wenn Zellen keinen Zugang zu einem vakuolären Arginin-Pool haben, regulieren sie ribosomale Proteine ​​herunter, reduzieren ihre Mitochondrienfunktion und versuchen, die zytoplasmatische Arginin-Biosynthese hochzuregulieren.

Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass dynamische Veränderungen im Aminosäurespiegel Veränderungen in der Proteinsynthesekapazität unterstützen, während Zellen den Zellzyklus durchlaufen36,37. Angesichts dessen, der offensichtlichen Koordination der Arginin-Biosynthese mit der Verfügbarkeit von Alanin, aromatischen und verzweigtkettigen Aminosäuren (Abb. 6d) und unserer Beobachtung, dass die Vakuole unmittelbar vor der Zellteilung am alkalischsten ist (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 1b), veranlasste uns zu der Frage, ob vakuoläre pH-Schwankungen Aspekte der Zellzyklusregulation beeinflussen. Insbesondere untersuchten wir die gut etablierte Koordination der Zellgröße bei der Geburt und der Zeit, die diese neugeborene Zelle benötigt, um sich auf ein DNA-Replikationsereignis festzulegen38,39. Dies wurde getestet, indem festgestellt wurde, ob mutierte Zellen, denen die Fähigkeit fehlt, während des Zellzyklus Aminosäuren aus der Vakuole freizusetzen, Defekte in diesen koordinierten Ereignissen aufweisen.

Um die Zellgröße zu messen, markierten wir die Plasmamembran mit mRuby2, fusioniert mit den ersten 28 Resten der palmitoylierten Plasmamembran-assoziierten Phosphatase Psr1. Um die Phototoxizität während des Bildgebungszeitraums zu minimieren, verwendeten wir ein speziell angefertigtes Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskop40, um vollständige volumetrische Daten zu erfassen, während die Zellen in SDC exponentiell wuchsen. Wir quantifizierten das Volumen der Tochterzelle, als sie sich von ihrer Mutter trennte, und das Wachstum, das die Tochterzelle durchlief, bevor sie mit der Bildung einer neuen Knospe begann (relative G1-Dauer). Die skalierte G1-Dauer korrelierte negativ mit der Zellgröße bei der Geburt in Wildtyp-Zellen (Abb. 7a, blaue Kreise und Zusatzvideo 12; Steigung ~ –1,0, P = <1 × 10–4). Wie zuvor beschrieben39, erfolgte der G1-zu-S-Übergang in diesen Wildtyp-Hefezellen unter einem Größenkontrollregime; In atg18∆-Zellen kam es jedoch zu einem Zusammenbruch der Größenkontrolle (Abb. 7a, rote Dreiecke und Zusatzvideo 13; Steigung ~ −0,2, P = 0,49). Das heißt, die Steigung der skalierten G1-Dauer gegenüber der logarithmisch transformierten Zellgröße bei der Geburt betrug ~−0,2 in atg18∆ statt ~−1,0 wie in Wildtyp-Zellen (P = 2,3 × 10−2, F-Test, Wildtyp versus atg18∆-Steigung). Dies deutet darauf hin, dass die richtige Größenkontrolle in Hefe zumindest teilweise auf der durch den Zellzyklus regulierten Koordination von Aminosäurepools beruht, die durch die dynamische Kontrolle des vakuolären pH-Werts erzeugt werden.

a, Diagramm des relativen Wachstums von G1 im Vergleich zu ln (Geburtsgröße) im Wildtyp (blaue Kreise) und atg18∆ (rote Dreiecke). Die Steigung der linearen Regression ist für jede Belastung im Einschub angegeben. b, Ein schematisches Modell zeigt die Regulierung des vakuolären pH-Werts beim Wachstum von WT-Zellen in Gegenwart von Alanin, verzweigtkettigen und aromatischen Aminosäuren (AAs). In Zellen ohne Knospen (links) ist der pH-Wert der Vakuolen saurer, was die Ansammlung von Aminosäuren im Lumen der Organelle vorantreibt. Während die Zellen wachsen (rechts), wird die Organelle weniger sauer und gibt Aminosäuren in das Zytoplasma ab. Die pH-Regulierung erfordert eine Pho85/Pcl6/Pcl7-abhängige Stimulation des Fab1-Komplexes zur Produktion von PtdIns(3,5)P2, das Atg18 rekrutiert und wechselseitig TORC1 und die v-ATPase aktiviert. Während des Wachstums sinken die PtdIns(3,5)P2-Spiegel an der Vakuole, was wiederum sowohl TORC1 als auch v-ATPase herunterreguliert, was zu einem Anstieg des vakuolären pH-Werts und dem Ausfluss von vakuolär gespeicherten Aminosäuren führt. Mutierte Zellen, die während des Wachstums nicht in der Lage sind, den vakuolären pH-Wert zu schwanken (unten), regulieren ribosomale und mitochondriale Gene herunter und regulieren die Argininbiosynthese hoch, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Diese Ereignisse führen zu einer gestörten Koordination der Zellgröße und des Timings für die Initiierung der DNA-Replikation. Ox-Phos, oxidative Phosphorylierung.

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Mikroorganismen und viele metazoische Zelltypen sind darauf abgestimmt, Nährstoffe aufzunehmen, wenn sie verfügbar sind, und dies mit schnellem Wachstum zu koordinieren. Infolgedessen haben sich homöostatische Mechanismen entwickelt, um trotz schwankender Nährstoffverfügbarkeit und/oder zellulärer Nachfrage (z. B. Wachstum und Proteinsekretion) ein angemessenes Niveau an zellulären Metaboliten aufrechtzuerhalten. Jüngste Arbeiten in Gewebekulturen mit Säugetierzellen41 ergaben, dass die Aufnahme und Speicherung von Aminosäuren in Lysosomen unter nährstoffreichen Bedingungen entscheidend für die Unterstützung der Translation bei Nährstoffmangel ist; Es ist jedoch weniger klar, ob die Kompartimentierung von Aminosäuren in aktiv wachsenden Zellen wichtig ist42.

Die vorliegende Studie enthüllt eine neue und unerwartete Ebene der Regulierung des vakuolären pH-Werts und der Aminosäurehomöostase in unbelasteten, wachsenden Zellen. Wir stellen fest, dass Zellen, die in Gegenwart von Alanin, verzweigtkettigen oder aromatischen Aminosäuren wachsen, einmal pro Zellzyklus regelmäßige vakuoläre Alkalisierungs- und Rücksäuerungsereignisse durchlaufen (Abb. 7b). Wir schlagen vor, dass Zellen über zytoplasmatische Aminosäure-Sensormechanismen verfügen, die verschiedene intra- und extrazelluläre Stoffwechselsignale (glykolytische versus respiratorische Kohlenstoffquelle und Aminosäuretyp; siehe Abb. 2) integrieren, um Aminosäuren durch dynamische Modulation des vakuolären pH-Werts zu binden und dann zu mobilisieren ein Versuch, die Aminosäurehomöostase während des Zellwachstums aufrechtzuerhalten. In Übereinstimmung mit der Rolle des Kohlenstoffquellenstoffwechsels bei der Aminosäurehomöostase wurde berichtet, dass die Unterdrückung des Kohlenstoffkataboliten über die TORC1-Signalübertragung funktionell mit dem Aminosäurestoffwechsel verknüpft ist43.

Unsere Daten legen nahe, dass Zellen interne Pools gespeicherter Aminosäuren als Puffer nutzen, um mehrere Zellsysteme einschließlich Translation, Mitochondrienfunktion und Zellgröße zu unterstützen. Wir schlagen vor, dass Zellen, wenn sie nicht in der Lage sind, den vakuolären pH-Wert in Gegenwart bestimmter extrazellulärer Aminosäuren dynamisch zu regulieren, möglicherweise nicht in der Lage sind, vakuoläre Pools von Aminosäuren wie Arginin freizusetzen. Dieses Defizit führt zu einer verringerten Translationskapazität durch Herunterregulierung der ribosomalen Transkriptspiegel, zu einer verringerten Mitochondrienfunktion durch Herunterregulierung der oxidativen Phosphorylierungsgene (Abb. 6a) und infolgedessen zu einer fehlregulierten Koordination der Zellgröße und des Timings von G1 (siehe Abb. 7a). Die Aufrechterhaltung der Translationskapazität und/oder der Mitochondrienfunktion während des Zellwachstums kann sich auf die Translation wichtiger regulatorischer Proteine ​​des Zellzyklus auswirken, wie z. B. den wichtigen Regulator des G1-zu-S-Übergangs, Cln3, oder durch die Regulierung anderer Zellzyklusschritte, die Metaboliten erkennen /Aminosäurespiegel der Zelle44,45,46.

Darüber hinaus kann die Sequestrierung von Aminosäuren in der Vakuole auf eine andere Weise für die zelluläre Homöostase wichtig sein: die Verhinderung eines Aminosäureungleichgewichts bei Nährstoffreichtum in der Umwelt. Solche Ungleichgewichte können eine Reihe zellulärer Prozesse beeinträchtigen. Aminosäure-Ungleichgewichte können zu einer Fehlbeladung der Transfer-RNA und folglich zu einer Fehlübersetzung führen47. Darüber hinaus sind die Aminosäurekonzentration und die Codon-Optimalität eine wichtige Triebfeder für die mRNA-Stabilität48. Ungleichgewichte der Aminosäuren können aufgrund der Feed-Forward-Hemmung auch den Fluss durch die anabolen Wege verändern35. Kürzlich wurde gezeigt, dass überschüssiges Cystein im Zytoplasma während des Alterungsprozesses zum Zusammenbruch der Eisen-Schwefel-Cluster-Biogenese und der Mitochondriengesundheit führt4.

Der detaillierte Mechanismus, wie vakuoläre Säure während des Zellwachstums verloren geht und dann wiedergewonnen wird, dürfte mechanistisch komplex sein. Unsere Daten zeigen, dass die Erzeugung von v-ATPase, TORC1, Pho85 (oder CDK5) und PtdIns(3,5)P2 eine Rolle bei der Regulierung der vakuolären pH-Dynamik während des Zellzyklus spielt (Abb. 7b). Unsere Beobachtung, dass das PtdIns(3,5)P2-Bindungsprotein und Regulator des Fab1-Komplexes, Atg18, dynamisch an die vakuoläre Grenzmembran rekrutiert wird, legt nahe, dass die wichtige regulatorische Lipidspezies PtdIns(3,5)P2 in wachsenden Zellen oszillieren könnte (Abb. 4a). Während eine Beeinträchtigung des Fab1-Kinase-Kernkomplexes zu niedrigeren PtdIns(3,5)P2-Spiegeln und eine Beeinträchtigung der Atg18-Funktion zu höheren PtdIns(3,5)P2-Spiegeln führt, blockieren beide individuellen Störungen vakuoläre pH-Schwankungen. Dies deutet darauf hin, dass der entsprechende Kreislauf von PtdIns(3,5)P2 für die Koordinierung verschiedener Phasen der vakuolären Ansäuerung und Alkalisierung wesentlich ist, obwohl es auch möglich ist, dass Atg18 eine direktere Rolle bei der Regulierung der Aminosäurefreisetzung aus der Vakuole spielt. Die Bedeutung von PtdIns(3,5)P2 bei der Regulierung der v-ATPase und TORC1 sowie die Rolle des auf Nährstoffe reagierenden CDK Pho85 bei der Modulation der Fab1-Aktivität legen nahe, dass es ein reichhaltiges regulatorisches Netzwerk gibt, das einer weiteren mechanistischen Analyse bedarf. Darüber hinaus erhöht die Tatsache, dass alle diese biologischen Wege hoch konserviert sind, die Möglichkeit, dass der lysosomale pH-Wert und die Mobilisierung lysosomaler Metaboliten in anderen Eukaryoten dynamisch reguliert werden. Wir gehen insbesondere davon aus, dass diese Dynamik unter Bedingungen wichtig sein wird, bei denen ein erhöhter Bedarf an Proteinsynthese oder anderen Aspekten des Zellstoffwechsels einen Vorteil für ein schnelles Zellwachstum bietet, wie etwa bei Embryogenese, Krebs und der Aktivierung ruhender Stammzellen.

Jüngste Arbeiten legen nahe, dass die Biosynthesewege von Aminosäuren für bestimmte Phasen des Zellzyklus optimiert werden, um die Translation von Proteinen mit verzerrter Aminosäurezusammensetzung zu unterstützen37. Wir schlagen vor, dass Hefen auch die vakuoläre pH-Regulierung und Aminosäuremobilisierung nutzen, um diese Versuche zur Aufrechterhaltung der Translationskapazität während des Zellzyklus zu verstärken (Abb. 7b). Bemerkenswerterweise deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Unfähigkeit, den vakuolären pH-Wert zu schwanken, zu einer Fehlregulation der bekannten Kontrolle der Größenhomöostase in Hefen führt. Während der genaue Mechanismus der Größenkontrolle weiterhin umstritten ist36,44,49,50,51, deuten unsere Daten darauf hin, dass die dynamische vakuoläre pH-Regulierung und ihre mögliche Auswirkung auf den zytoplasmatischen pH52 eine wichtige Rolle spielen könnten.

Insgesamt identifiziert diese Arbeit ein neues Modell für die dynamische Regulierung der Metabolitenspeicherkapazität einer Organelle im Zentrum vieler kritischer Zellwege. Angesichts der Bedeutung und des hohen Grades der Konservierung zwischen Mensch und Hefe in allen in der hier beschriebenen Arbeit identifizierten Signalwegen ist es erwähnenswert, dass Mutationen in den konservierten Fab1-, v-ATPase- und TORC1-Komplexen alle Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben53,54,55 , was die Möglichkeit erhöht, dass Defekte in der Dynamik der Aminosäurespeicherung in der lysosomenähnlichen Vakuole Aspekten der Mechanismen der Entstehung oder des Fortschreitens verschiedener menschlicher Krankheiten zugrunde liegen könnten.

Alle in dieser Studie verwendeten Stämme sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Alle prototrophen Stämme stammen aus dem DHY-Hintergrund56. Alle Knockout- und genmarkierten Stämme wurden in einem diploiden DHY-Elternstamm hergestellt und haploide Stämme wurden durch Sporulation, Tetradendissektion und Überprüfung der Segregation der entsprechenden Marker erzeugt. Alle Deletionsstämme wurden unter Verwendung der von der Knop-Gruppe57 beschriebenen dominanten Arzneimittelresistenzmarker hergestellt. c-terminale mNeon-markierte Proteine ​​wurden durch Amplifikation einer Integrationskassette aus pKT127-mNeonGreen hergestellt. Stämme, die Reporter zur Überwachung des vakuolären pH-Werts enthalten, wurden durch Integration des Konstrukts am HO-Locus wie beschrieben58 unter Verwendung der unten als „pHO“ bezeichneten Plasmide hergestellt. Stämme, die genomisch kodiertes mCherry-Atg18 enthalten, wurden durch Amplifikation eines PCR-Fragments hergestellt, das die NatMX-Kassette, gefolgt von der ADH1-Promotorregion und mCherry, enthielt. Das gesamte Fragment wurde am 5'-Ende des nativen Atg18-Locus integriert und durch PCR verifiziert. Stämme, die Psr1-mRuby2 exprimieren, wurden durch Amplifikation des Plasmids pADH1pr-PSR1-mRuby2 mit Primern hergestellt, die die Insertion des Konstrukts in eine leere Region von Chromosom I (199.458–199.459) in einem ura3− DHY WT-Stamm ermöglichen. Stämme, die fab1-21a und vac7-7a beherbergen, wurden durch Amplifikation eines PCR-Fragments, das die NatMX-Kassette enthielt, nach den mutierten Varianten jedes Gens hergestellt. Jedes Fragment wurde am nativen Fab1- bzw. Vac7-Locus integriert.

pKT127-mNeonGreen wurde durch Amplifikation von mNeonGreen mit PacI- und AscI-Stellen und Ersetzen von eGFP in pKT127-eGFP59 hergestellt.

pHO-KanMX-TEF1prom-CPYleader-v-SEP-mCherry wurde hergestellt, indem zunächst ein Donorplasmid erstellt wurde, das die ersten 50 Aminosäuren von CPY (Prc1) enthielt, die durch Annealing komplementärer Oligonukleotide, flankiert von XbaI- und SpeI-Stellen, und v-SEP, flankiert von, eingeführt wurden SpeI- und XhoI-Sites. Das CPYleader-v-SEP-Fragment wurde dann durch PCR so amplifiziert, dass es flankierende BamHI- und XhoI-Stellen enthielt, und unter Verwendung dieser Stellen in p416TEF60 kloniert. Das TEFprom-CPYleader-v-SEP-CYCterm wurde dann amplifiziert und unter Verwendung von SmaI in pHO-KanMX58 kloniert. Hefe-Codon-optimiertes mCherry (yemCherry) wurde dann stromabwärts und im Rahmen von v-SEP unter Verwendung von HiFi-DNA-Assemblierung (NEB) gemäß dem Protokoll des Herstellers kloniert.

pHO-NatMX-TEF1prom-CPYleader-v-SEP-mScarlet wurde durch Ersetzen der KanMX-Kassette von pHO-KanMX durch NatMX unter Verwendung eines DNA-Fragments hergestellt, das aus pFA6a-NatMX-NT257 verdaut wurde, flankiert von AscI und EcoRI. Hefe-Codon-optimiertes mScarlet (yemScarlet) wurde dann stromabwärts und im Rahmen von v-SEP unter Verwendung von HiFi-DNA-Assemblierung (NEB) gemäß dem Protokoll des Herstellers kloniert.

pUC19-ADH1pr-mCherry-Atg18 wurde hergestellt, indem zunächst die NatMX-NT2-Kassette von pFA6a-NatNT257, flankiert von EcoRI- und SacI-Restriktionsenzymstellen, amplifiziert und in pUC19 kloniert wurde. Der Rest des Konstrukts wurde sequentiell so konstruiert, dass das endgültige Konstrukt den ADH1-Promotor, flankiert von SacI- und Der yemCherry- und der ATG18-ORF sind durch einen 6×-Glycin-Linker getrennt, der durch PCR eingeführt wurde.

pADH1pr-PSR1-mRuby2 wurde hergestellt, indem ratiometrisches Phluorin (RMP) in pADH1pr-PSR1-RMP61 durch mRuby2 unter Verwendung der flankierenden PacI- und AscI-Stellen ersetzt wurde. Dieses Plasmid ist durch eine URA3-Selektionskassette markiert.

Plasmide, die fab1-21a oder vac7-7a mit ihrem nativen Promotor und Terminator, flankiert von NotI- und SbfI-Stellen, enthalten, wurden von Twist Bioscience synthetisiert und in pUC19 kloniert. NatMX wurde mit flankierenden SbfI-Stellen amplifiziert und stromabwärts kloniert.

Alle zur Konstruktion von Hefestämmen und Plasmiden verwendeten Oligos sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Alle Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert.

SDC enthielt SC-Ergänzungsmischung (Sunrise), YNB + Stickstoff (Ammoniumsulfat)-Mischung (Sunrise) und 2 % Dextrose, pH 4,5. Dieses Medium hatte ohne jegliche Zusätze einen konstanten pH-Wert von ~4,5. YNBD enthält eine Mischung aus YNB + Stickstoff (Ammoniumsulfat) (Sunrise) und 2 % Dextrose und wurde durch Zugabe von KOH auf einen pH-Wert von ~4,5 eingestellt, um SDC zu entsprechen. Alle einzelnen Aminosäure-Addback-Medien verwendeten 85,6 mg l-1 Aminosäuren, mit Ausnahme von Leucin, das 173,4 mg l-1 betrug. Das Addback-Medium für alle einzelnen Aminosäuren wurde auf einen pH-Wert von ~4,5 eingestellt. SCEG enthielt SC-Ergänzungsmischung (Sunrise), YNB + Stickstoff (Ammoniumsulfat)-Mischung (Sunrise), 2 % Glycerin und 3 % Ethanol, pH 4,5. Alle Experimente und das Hefezellwachstum wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Rapamycin (Fisher) wurde zu 1 mg ml-1 in 90 % Ethanol/10 % Tween-20 resuspendiert und in einer Arbeitskonzentration von 1 µg µl-1 in SDC verwendet. Concanamycin A (MiliporeSigma) wurde zu 1 mg ml-1 in Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert und in einer Arbeitskonzentration von 1 µg ml-1 in SDC verwendet. Bei allen Behandlungen wurden die Zellen 9 Stunden lang in unbehandeltem Medium in Mikrofluidikgeräten gezüchtet, und dann wurde der Fluss des wirkstoffhaltigen Mediums automatisch durch das unten beschriebene Mikrofluidiksystem eingeleitet.

Die Zellen wurden 24 Stunden lang im geeigneten Medium kultiviert und dann auf eine geeignete OD600 verdünnt, so dass nach 12–16 Stunden Wachstum die Zelldichte am nächsten Tag zwischen OD600 0,05 und 0,1 lag. Dies diente zwei Zwecken: der Erzielung einer geeigneten Zellbeladungsdichte und der Begrenzung der Ansäuerung des Mediums in der Starterkultur. Die Zellen wurden in eine CellASIC ONIX-Platte für haploide Hefezellen (Y04) geladen und das entsprechende Medium wurde unter Verwendung eines CellASIC ONIX2-Mikrofluidiksystems (Millipore) 1.000 Minuten lang über die Zellen fließen lassen (21 kPa).

Für die in Abb. 1d dargestellten Daten wurde eine benutzerdefinierte Mikrofluidikplattform9 verwendet, um etwa 1.000 Minuten lang alle 5 Minuten v-SEP- und mCherry-Fluoreszenz abzubilden.

v-SEP- und mCherry-Fluoreszenz wurde auf einer Nikon Ti aufgezeichnet, die mit einer Andor Neo sCMOS-Kamera, Standard-FITC/TRITC-Filtersätzen, einer Sola 6 LED-Lichtquelle (Lumencor) und einem ×60-Objektiv ausgestattet war. Alle Daten wurden als einzelne mediale Fokalebenenbilder mit Fluoreszenz- und Hellfelddaten erfasst, die alle 2 Minuten unter Verwendung einer 50-ms-Belichtung mit 12 % einfallender Lichtintensität für v-SEP und einer 150-ms-Belichtung mit 12 % einfallender Lichtintensität für mCherry erfasst wurden.

Zellen, die v-mScarlet exprimierten, wurden in SDC gezüchtet und Fluoreszenzlebensdauerdaten wurden mit einem konfokalen Leica SP8-Punktscanmikroskop gesammelt, das mit einem LSM/FLIM-Modul (PicoQuant) für zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung ausgestattet war. Um Phototoxizität zu vermeiden, haben wir kontinuierlich mit sehr geringer Laserintensität abgebildet. Wir verwendeten ein HC PL APO CS ×100/1,4 NA-Objektiv, Beleuchtung durch einen abstimmbaren Weißlichtlaser bei 40 MHz mit einem 561-Anregungsfilter, einer Pixelgröße von 151,96 nm und einer Verweilzeit von 97,65 μs. Die 256 × 256 Pixel großen Bilder wurden mit einer offenen Lochblende auf einem HyD-SMD-Detektor mit einem Emissionsfenster von 581–750 nm aufgenommen. Die Aufnahme jedes Bildes dauerte 26 Sekunden. Wir verwendeten die Picoquant-Software, um die durchschnittliche Photonenankunftszeit anzuzeigen, indem wir vier Bilder zeitlich gruppierten und eine zweidimensionale Glättung von 500 nm anwendeten.

Die Zellen wurden wie oben angegeben in SDC gezüchtet und mit 5 µM BCECF (Thermo Fisher) behandelt. Die BCECF-Fluoreszenz wurde auf einem Leica DMi8 aufgezeichnet, der mit einer pco.edge 4.2-Kamera (pco), einer SpectraX-LED-Lichtquelle (Lumencor) und einem ×60-Objektiv ausgestattet war. Sowohl pH-empfindliche als auch unempfindliche BCECF-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines 540/21-Emissionsfilters und eines dichroitischen Spiegels FF444/520/590-Di01 (Semrock) erhalten. Eine pH-unempfindliche Fluoreszenz wurde erhalten, indem die Probe mit einem 427/10-Bandpassfilter beleuchtet wurde, und eine pH-unempfindliche Fluoreszenz wurde mit einem 540/21-Bandpassfilter erzielt. Für beide Fluoreszenzsignale wurde das einfallende Licht auf 30 % Leistung abgeschwächt und eine Belichtungszeit von 45 ms verwendet.

Die Zellen wurden wie oben beschrieben in YNBD + 4cnTrp (85,6 mg l−1) gezüchtet. v-SEP- und 4cnTrp-Fluoreszenz wurden auf einem Leica DMi8 aufgezeichnet, der mit einer ORCA-Flash4.0-Kamera (Hamamatsu), Standard-FITC/DAPI-Filtersätzen, einer Sola-Lichtmaschine (Lumencore) und einem ×100 HC PL Apo TIRF-Objektiv ausgestattet war. Alle Daten wurden als einzelne mediale Fokalebenenbilder mit Fluoreszenz- und Hellfelddaten erfasst, die alle 2 Minuten unter Verwendung einer 25-ms-Belichtung mit 15 % einfallender Lichtintensität für v-SEP und einer 200-ms-Belichtung mit 15 % einfallender Lichtintensität für 4cnTrp erfasst wurden.

Die Zellen wurden wie oben beschrieben in SDC gezüchtet und 5 Minuten lang auf einem 24 × 60 mm großen Nr. 1 absetzen gelassen. 1 Glasdeckglas, das mit 0,1 mg ml−1 Concanavalin A (Fisher) beschichtet war. Ein Ring aus Vakuumfett wurde verwendet, um eine offene Mulde um die Zellen herum zu erzeugen. Nach dem Absetzen wurden nicht anhaftende Zellen mit frischem Medium abgewaschen und ein Überschuss an frischem Medium in die Vertiefung gegeben (~500 µl). Die v-SEP-Fluoreszenz wurde auf einer Nikon Ti aufgezeichnet, die mit einer Andor Neo sCMOS-Kamera, Standard-FITC-Filtersätzen, einer Sola 6 LED-Lichtquelle (Lumencor) und einem ×60-Objektiv ausgestattet war. Alle Daten wurden als einzelne mediale Fokalebenenbilder mit Fluoreszenz- und Hellfelddaten erfasst, die alle 2 Minuten unter Verwendung einer 50-ms-Belichtung mit 12 % einfallender Lichtintensität für v-SEP erfasst wurden.

Ein SOLS-Mikroskop mit einem Nikon ×100 1,35-Silikon-Primärobjektiv wurde verwendet, um einfarbige volumetrische Zeitreihendaten zu sammeln (Details zur Mikroskopkonfiguration finden Sie an anderer Stelle40). Zur Fluoreszenzanregung und -emission wurde ein 561-nm-Laser (Coherent OBIS LS 80 mW) in Verbindung mit einem dichroitischen Quadband-Filter (Chroma ZT405/488/561/640rpcv2) und einem Langpass-Emissionsfilter (Chroma LP02-561RU) verwendet. Insgesamt wurden 240 Volumina pro Datensatz in 300-s-Intervallen mit einer Voxelgröße von (116 × 116 × 469) nm3 (108 Schichten pro Volumen und 1.060 × 548 Pixel pro Schicht in der Praxis) aufgenommen. Jeder Bildausschnitt wurde mit einer 100-ms-Belichtung und relativ geringer Laserleistung aufgenommen, um Lichtschäden zu minimieren (5 %-Einstellung + Thorlabs NDE10A-Absorptionsfilter).

Doppelte Kulturen an zwei getrennten Tagen (insgesamt vier Replikate) wurden im geeigneten Medium bis zu OD600 = 0,05 gezüchtet, durch Filtration auf MF-Membranfiltern (Millipore, HAWP02500) gesammelt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Gefrorene Zellen wurden wie an anderer Stelle beschrieben verarbeitet62. Kurz gesagt, die Zellen wurden in 200 µl Lysepuffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,5 % SDS und 10 mM EDTA) resuspendiert und von den Filterscheiben getrennt. Dann wurden 200 µl saures Phenol, pH 4,3, zugegeben und die Proben 30 s lang gevortext. Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 65 °C in einem Thermomixer unter intermittierendem Schütteln (2.000 U/min für 1 Minute alle 15 Minuten) inkubiert. Dann wurden 400 µl 100 % Ethanol zugegeben und die RNA mit dem Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit (Zymo Research) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt, einschließlich des DNase-Verdauschritts. Die RNA-Integrität wurde mit einem Agilent Bioanalyzer bewertet und eine WT-Probe wurde aus der Analyse ausgeschlossen, da die RNA von unzureichender Qualität war.

Die RNA-seq-Analyse wurde mithilfe einer hauseigenen, webbasierten Plattform durchgeführt und visualisiert und bestand aus den folgenden Schritten. Die Qualitätskontrolle der Sequenzierung wurde mit FastQC (v.0.11.5) durchgeführt. Die Transkriptexpression wurde dann mit Salmon63 (v.0.9.1) im Pseudo-Alignment-Modus ohne Adaptertrimmen quantifiziert, wodurch Schätzungen der Transkripte pro Million unter Verwendung des Ensembl-Transkriptoms (SacCer3) erstellt wurden. Die Analyse der differentiellen Expression wurde in R unter Verwendung des Sleuth-Pakets64 (v.0.29.0) durchgeführt und ergab Effektgrößen und q-Werte auf Genebene für atg18∆, vph1∆ und fab1∆ im Vergleich zu WT. Die Liste der nach q-Wert geordneten Gene wurde dann zur Durchführung der GSEA unter Verwendung des fgsea-Pakets65 (v.1.4.1) verwendet. RNA-seq-Daten sind beim Gene Expression Omnibus (GSE236913) hinterlegt.

Die Zellen wurden über Nacht im geeigneten Medium gezüchtet, in frischem Medium auf OD600 = 0,03–0,05 verdünnt und 2–3 Stunden lang gezüchtet. Die Zellen wurden im Medium mit 1 µM SYTOX Blue (Thermo Fisher) 5 Minuten lang gefärbt und dann auf einem BD LSRFortessa X-20 Cell Analyzer analysiert, der mit den entsprechenden Laserlinien und Emissionsfiltersätzen ausgestattet war. FACS-Daten wurden mit der FACSDiva-Software (v.9.0) erfasst. An mehreren Tagen wurden mindestens 30.000 Zellen pro Wachstumsmedium analysiert. Eine repräsentative Gating-Strategie für eine Probe (WT-Zellen, die Arg1-mNeon exprimieren und in YNBD wachsen) ist in Extended Data Abb. 6 dargestellt. Lebende Zellen wurden mithilfe des SYTOX Blue-Signals (Gate 4, Extended Data Abb. 6) gesteuert. Alle Zytometriedaten wurden von FlowJo (v.10.8.1) analysiert. Zweiseitige t-Tests wurden in R (v.4.1.2) durchgeführt und aufgrund der großen Stichprobengröße wurde von Normalität der Daten ausgegangen.

Daten aus Mikrofluidik-Experimenten wurden mit Fiji (1,53k) und dem TrackMate-Plugin (v.6.0.3) verarbeitet. Um Daten für die Analyse in TrackMate zu verarbeiten, wurden Zeitrafferdaten mithilfe der Rolling-Ball-Subtraktion mit einem Radius von 50 Pixeln vom Hintergrund subtrahiert und dann mit dem StackReg66-Plugin registriert. TrackMate wurde dann verwendet, um Vakuolen zu segmentieren (LoG-Detektor: geschätzter Blob-Durchmesser von 27 Pixeln, Schwelle von 0,3) und ihre Fluoreszenz im Zeitverlauf zu verfolgen (Linear Motion Lap Tracker: anfänglicher Suchradius von 25 Pixeln, Suchradius von 20 Pixeln).

Die TrackMate-Ausgaben wurden mithilfe benutzerdefinierter R-Skripte analysiert. Kurz gesagt, einzelne Fluoreszenzintensitätsspuren wurden so ausgewählt, dass Daten von mindestens 500 Minuten vorlagen, die Daten wurden mithilfe eines linearen Zeitreihenmodells (Forecast::tslm) trendbereinigt und es wurde eine PSD-Analyse durchgeführt (Genecycle::Periodogramm). Trendbereinigte Daten und die maximale Amplitude sowie die Periode der maximalen Amplitude wurden für jede Kurve notiert. Dieser Prozess wurde über alle Daten einer bestimmten Wachstumsbedingung wiederholt. Die mittleren maximalen Amplituden und das 95 %-KI für jede Wachstumsbedingung oder Mutante wurden mithilfe der Funktion datawizard::describe_distribution (data, centrality = 'median', ci = TRUE)) in R (v.4.1.2 (2021-11-)) berechnet. 01)).

BY4741-Hefe, die v-SEP aus einem p416-Plasmid mit einem GAP-Promotor und einem CYC1-Terminator exprimiert, wurde über Nacht in 10 ml SC-Medium ohne Uracil gezüchtet. Die Proben wurden abzentrifugiert, gewaschen und in 500 µl Wasser resuspendiert. Anschließend wurden 10 µl der Resuspension mit 90 µl Carmody67-Puffer bei unterschiedlichem pH-Wert in einer 384-Well-Platte kombiniert und mit 1 µl 10 % Digitonin in DMSO permeabilisiert. Anregungsspektren wurden in einem SpectraMax i3x-Spektrophotometer von unterhalb der Probe aufgenommen.

4cnTrp wurde zu einer gepufferten pH-Reihe67 in Platten mit Glasboden (Corning) gegeben und die Fluoreszenz (Bsp. 360/20, Em. 460/30) wurde mit einem CLARIOstar Plus-Plattenlesegerät von der Oberseite der Platte aus gemessen.

BCECF-Kalibrierungskurven wurden durch Permeabilisierung von Hefen in 50 mM MES, 50 mM Hepes, 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M Ammoniumacetat, 10 mM NaN3, 10 mM 2-Desoxyglucose und 50 µM FCCP erhalten. Der pH-Wert des Puffers wurde in Schritten von 0,5 pH-Einheiten angepasst und die Bilder wurden mit denselben Mikroskopaufnahmeeinstellungen aufgenommen, die für den oben beschriebenen Zeitraffer verwendet wurden.

3D-Volumendaten wurden mit maximaler Intensität projiziert und die Längs- und Kurzachse der Zelle nach der Trennung von ihrer Mutter gemessen. Das Zellvolumen wurde unter Verwendung der Formel für das Volumen eines Ellipsoids V = (4/3) × (lange Achse) × (kurze Achse)2 berechnet. Die skalierte G1-Dauer wurde wie anderswo berechnet68. Statistische Tests zur Signifikanz der Steigung der linearen Regression und der Vergleich von WT- und atg18∆-Daten wurden mit GraphPad Prism 9 durchgeführt.

Es wurde keine statistische Methode verwendet, um die Stichprobengröße vorab zu bestimmen, und es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Alle für die Analyse verwendeten statistischen Tests sind in den Methoden oder in den Quelldatendateien für jede Abbildung enthalten. Die Daten waren sowohl auf biologischer als auch auf technischer Ebene gut reproduzierbar.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Über das hinaus, was im Manuskript verfügbar ist, werden alle Daten (roh und verarbeitet) sowie Analysetools oder benutzerdefinierte Skripte von den entsprechenden Autoren auf begründete Anfrage zur Verfügung gestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken F. Arnold für die Bereitstellung des 4cnTrp. Wir danken I. Le Blanc und allen Mitgliedern des Gottschling-Labors für die hilfreiche Diskussion und Durchsicht des Manuskripts.

Voytek Okreglak

Aktuelle Adresse: Altos Labs, Redwood City, CA, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Rachel Ling, Maria Ingaramo.

Calico Life Sciences, LLC, South San Francisco, CA, USA

Voytek Okreglak, Rachel Ling, Maria Ingaramo, Nathaniel H. Thayer, Alfred Millett-Sikking und Daniel E. Gottschling

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VO und DEG konzipierten und betreuten das Projekt, entwarfen Experimente, interpretierten Ergebnisse und verfassten die Arbeit. VO analysierte RNA-seq-Daten, NHT und RL führten groß angelegte Mikrofluidik-Experimente durch, die Abb. 1d zugrunde liegen. MI hat den v-SEP-Reporter erstellt und charakterisiert. AM-S. und VO führten Experimente mit dem Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskop durch. RL und VO führten und analysierten FACS-Experimente und führten/analysierten alle anderen Experimente im Manuskript durch.

Korrespondenz mit Voytek Okreglak oder Daniel E. Gottschling.

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Calico Life Sciences. Die hier vorgestellte Arbeit ist für Calico nicht von kommerziellem Wert, sondern vielmehr ein Beitrag zur Weiterentwicklung des Verständnisses der Grundlagenbiologie.

Nature Metabolism dankt Patricia Kane und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur für Handhabung: Alfredo Giménez-Cassina, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Individuelle mCherry- und v-SEP-Intensitäten und das Verhältnis der beiden Signale, die 1000 Minuten lang alle 2 Minuten abgebildet werden. (b) Zellen, die v-SEP und Psr1-mRuby2 exprimieren, werden alle 2 Minuten abgebildet, während sie in SDC wachsen. Änderungen der Fluoreszenzintensität von v-SEP aus einer Zelle werden in Schwarz angezeigt, während der gestrichelte vertikale Balken den Zeitpunkt angibt, zu dem die Zelle geboren wurde. Vertikale grüne und rote gestrichelte Linien zeigen den Zeitpunkt der Initiierung bzw. Trennung jeder Tochterzelle an. (c) bar1∆-Zellen, die v-SEP exprimieren, werden alle 2 Minuten abgebildet, während sie in SDC mit 200 nM α-Faktor wachsen. Zellen durchlaufen eine Zellteilung (Zelltrennung durch gestrichelte rote Linie angezeigt), bevor sie zum Stillstand kommen (durch gestrichelte blaue Linie angezeigt). (d) Zellen, die v-SEP exprimieren, wurden in Batch-Kultur in SDC gezüchtet und konnten sich alle 2 Minuten auf einem Deckglas absetzen und fotografiert werden. Dargestellt sind v-SEP-Intensitätsänderungen im Zeitverlauf für zwei Zellen. (e) Zellen, die v-mScarlet exprimieren, wurden in SDC gezüchtet und die Fluoreszenzlebensdauern wurden wie in den Materialien und Methoden beschrieben erfasst. Die Fluoreszenzlebensdauern wurden pseudofarben dargestellt und Hellfeldbildern überlagert, wobei längere Lebensdauern in Magenta und kürzere Lebensdauern in Grün dargestellt wurden, was einem höheren bzw. niedrigeren pH-Wert entspricht.

Quelldaten

(a) Oszillierende vakuoläre pH-Amplitude von DHY- (n = 301), BY4741- (n = 99) und W303- (n = 90) Wildtyp-Zellen, die in Medien mit Glucose und Aminosäuren (SDC) gezüchtet wurden. Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm dargestellt, wobei die Whisker als 1,5 * Interquartilbereiche berechnet werden, die Medianwerte durch den horizontalen roten Balken angezeigt werden und die p-Werte durch einen zweiseitigen Dunn-Test mit Holm-Anpassung berechnet werden. Die unter den Balkendiagrammen eingefügten Zahlen geben die mittlere Periode der vakuolären pH-Schwankungen an. (b) Die Periode und Größe des vakuolären pH-Werts ist für die in Abb. 2b (rot), 2d (schwarz), 3a (blau), 3d (grün), 3e (magenta), 3 f (cyan), Erweiterte Daten, gezeigten Experimente aufgetragen Abb. 2a (grau) und Erweiterte Daten Abb. 3b (violett). Die durchgezogene horizontale schwarze Linie ist die Regressionslinie und der schattierte rote Bereich ist das 95 %-Konfidenzintervall um die Regressionslinie.

Quelldaten

(a) Tabelle der hochregulierten und herunterregulierten GO-Terme zum Vergleich von Wildtyp-Zellen, die in YNBD wachsen, mit YNBD + Tyr oder YNBD + Leu. (b) Oszillierende vakuoläre pH-Amplitude von gcn2∆ und Wildtyp-Zellen, die in Medien mit Glucose und Aminosäuren (SDC) gezüchtet wurden. Die mittlere vakuoläre pH-Amplitude wird als Box-and-Whisker-Diagramm dargestellt, wobei die Whisker als 1,5 * Interquartilbereiche berechnet werden, die Medianwerte durch den horizontalen roten Balken angezeigt werden und die p-Werte durch einen zweiseitigen Dunn-Test mit Holm-Anpassung berechnet werden. Die unter den Balkendiagrammen eingefügten Zahlen geben die mittlere Periode der vakuolären pH-Schwankungen an. (c) Einzelbilder aus der Zeitrafferaufnahme von mCherry-Atg18 und v-SEP während einer Runde der vakuolären Alkalisierung (wie Abb. 4a). Die unteren Diagramme zeigen die mCherry-Atg18-Intensität (rote Kurve) und die v-SEP-Intensität (grüne Kurve) entlang der roten Linie, die im mCherry-Atg18-Bild angezeigt wird. Eine horizontale gestrichelte Referenzlinie ist für alle Parzellen auf 150 AE festgelegt. (d) Einzelbilder aus der Zeitrafferaufnahme von Vma5-mCherry und v-SEP während einer Runde der vakuolären Alkalisierung.

Quelldaten

4cnTrp wurde zu einer gepufferten pH-Reihe hinzugefügt67 und die Fluoreszenz wurde mit einem CLARIOstar Plus-Plattenlesegerät gemessen. Der rot schattierte Bereich ist das 95 %-Konfidenzintervall um den Mittelwert (gestrichelte Linie).

Quelldaten

(a) mRNA-Expressionsprofile für Autophagie-Mutanten, extrahiert aus Kemmeren et. al, 201434 wurden auf Arginin-Biosynthese-Gene aufgeteilt. Die Daten werden so formatiert, dass hochregulierte Gene in Magentatönen und herunterregulierte Gene in Blautönen angezeigt werden. Signifikante Expressionsänderungen (p-Wert < 0,05) werden grün hervorgehoben. Alle Signifikanzwerte stammen von Kemmeren et. al. (b) Histogramme der Arg3-mNeon-Expression, analysiert durch Durchflusszytometrie, Vergleich der Arg3-Spiegel in Wildtyp- und atg18∆-Zellen in Medien, die Aminosäuren enthalten. Wildtyp x = 287,7 AU vs. atg18∆ x = 369,6 AU, zweiseitiger t-Test p-Wert < 2,2 × 10−16.

Quelldaten

Eine repräsentative Gating-Strategie für eine Probe (Wildtyp-Zellen, die Arg1-mNeon exprimieren und in YNBD wachsen), die für alle in diesem Manuskript vorgestellten FACS-Analysen verwendet wird.

Ergänzendes Video 1. v-SEP-mCherry-Fluoreszenz in in SDC gezüchteten Zellen. v-SEP (links), mCherry (Mitte) Intensität über die Zeit in Zellen, die in SDC in CellASICs-Geräten wachsen und alle 2 Minuten abgebildet werden. Rechts werden zusammengeführte Signale angezeigt (v-SEP in Grün und mCherry in Magenta). Ergänzendes Video 2. v-SEP-Fluoreszenz in in SDC gezüchteten Zellen. v-SEP-Fluoreszenz (links) im Zeitverlauf, aufgezeichnet (rechts) von Vakuolen zweier repräsentativer Zellen, die in SDC wachsen, hervorgehoben durch orange und blaue Kreise. Ergänzendes Video 3. v-SEP-Fluoreszenz in Zellen, die im Batch gezüchtet und nach dem Absetzen auf Deckglas abgebildet wurden. Zeitrafferdaten der v-SEP-Fluoreszenz in Zellen, die direkt aus einer diskontinuierlich gezüchteten SDC-Kultur an einem Glasdeckglas haften. Ergänzendes Video 4. Fluoreszenzlebensdauer von v-mScarlet in in SDC gezüchteten Zellen. Fluoreszenzlebensdauerbildgebung des vakuolären gezielten mScarlet-Wachstums in der DEZA. Fluoreszenzlebensdauern werden in Pseudofarben angezeigt und Hellfeldbildern überlagert, wobei längere Lebensdauern in Magenta und kürzere Lebensdauern in Grün dargestellt werden, was einem höheren bzw. niedrigeren pH-Wert entspricht. Ergänzendes Video 5. BCECF-Fluoreszenz in in SDC gezüchteten Zellen. Zeitrafferdaten zeigen Hellfeld und das ratiometrische Signal von vakuolär angesammeltem BCECF in Zellen, die in SDC wachsen. Ergänzendes Video 6. v-SEP-Fluoreszenz in in YNBD gezüchteten Zellen. v-SEP-Fluoreszenz (links) über der Zeit, aufgetragen (rechts) von Vakuolen zweier repräsentativer Zellen, die in YNBD (definiertes Medium mit Glucose, aber ohne Aminosäuren) wachsen, hervorgehoben durch orange und blaue Kreise. Ergänzendes Video 7. v-SEP-Fluoreszenz in in SCEG gezüchteten Zellen. Zeitrafferdaten zeigen die v-SEP-Fluoreszenz in Zellen, die in SCEG (definiertes Medium mit den respiratorischen Kohlenstoffquellen Glycerin/Ethanol und Aminosäuren) wachsen. Ergänzendes Video 8. v-SEP-Fluoreszenz in mit Rapamycin behandelten Wildtyp-Zellen. Zeitrafferdaten zeigen die v-SEP-Fluoreszenz in Zellen, die während der SDC-Behandlung vor und nach der Rapamycin-Behandlung wachsen.

Ergänzendes Video 9. v-SEP-Fluoreszenz in mit ConcA behandelten Wildtyp-Zellen. Zeitrafferdaten zeigen die v-SEP-Fluoreszenz in Zellen, die in der SDC-Behandlung vor und nach der ConcA-Behandlung wachsen. Ergänzendes Video 10. mCherry-Atg18- und v-SEP-Fluoreszenz in in SDC gezüchteten Wildtyp-Zellen. Zeitrafferdaten zeigen die Fluoreszenz von mCherry-Atg18 (links) und v-SEP (rechts) in Zellen, die in SDC wachsen. Ergänzendes Video 11. 4cnTrp- und v-SEP-Fluoreszenz in Wildtyp-Zellen, die in YNBD+4cnTrp gezüchtet wurden. Zeitrafferdaten zeigen die 4cnTrp-Fluoreszenz (links) und die v-SEP-Fluoreszenz (rechts) in Zellen, die in der SDC-Behandlung vor und nach der ConcA-Behandlung wachsen. Ergänzendes Video 12. Psr1-mRuby2-Fluoreszenz in Wildtyp-Zellen, abgebildet durch Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopie. Maximalintensitätsprojektionen vollständiger volumetrischer Zeitrafferdaten der Psr1-mRuby2-Fluoreszenz in in SDC gezüchteten Wildtyp-Zellen. Ergänzendes Video 13. Psr1-mRuby2-Fluoreszenz in atg18∆-Zellen, abgebildet durch Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopie. Maximalintensitätsprojektionen vollständiger volumetrischer Zeitrafferdaten der Psr1-mRuby2-Fluoreszenz in in SDC gezüchteten atg18∆-Zellen.

In dieser Studie verwendete Stämme.

In dieser Studie verwendete Oligonukleotide.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung von Abb. 1.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung von Abb. 2.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung von Abb. 3.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung von Abb. 4.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung von Abb. 5.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung von Abb. 6.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung von Abb. 7.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung der erweiterten Abbildung 1.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung der erweiterten Abbildung 2.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung der erweiterten Abbildung 3.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung der erweiterten Abbildung 4.

Quelle und zusätzliche Datenelemente zur Unterstützung der erweiterten Abbildung 5.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Okreglak, V., Ling, R., Ingaramo, M. et al. Die mit dem Zellzyklus verbundene vakuoläre pH-Dynamik reguliert die Aminosäurehomöostase und das Zellwachstum. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00872-1

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Eingegangen: 03. Juni 2022

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00872-1

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